鼠傷寒沙門菌新型轉錄因子STM0859的基因克隆、分子特征及其遺傳進化分析

馬忠梅，寧程程，郭 蘊，季春暉，孟慶玲，喬 軍*，張星星，才學鵬

(1. 石河子大學動物科技學院, 新疆 石河子 832003; 2. 新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所, 新疆 石河子 832000; 3. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所, 甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】鼠傷寒沙門菌(SalmonellaentericasubspeciesentericaserovarTyphimurium，ST)屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性[1]、桿狀及兼性厭氧菌[2]，是一種重要的人獸共患病原菌之一[3]。ST廣泛存在于自然界，可在污水、動物排泄物和土壤中長期存活[4]。同時，ST可以感染在多種家禽和家畜，并且通過動物源性食品引起人類感染，導致食物中毒。此外，該菌在不利的環境中易形成生物被膜，可增強該菌對化學物質、應激(紫外輻射、滲透壓和干燥等)、抗生素和宿主免疫系統具有較強的抵抗力[5]，給該菌引起相關疾病的防控帶來巨大的挑戰?！厩叭搜芯窟M展】大量的研究表明，ST可在多種毒力因子的參與下感染多種宿主，其完成侵染、胞內生存、繁殖和致病等生活過程需要多種調控因子的協同作用[6]。研究發現，LysR型轉錄因子家族在細菌群體感應、毒力、細菌耐藥性、生物被膜形成和細胞分裂的調控相關，但LysR轉錄調節因子在鼠傷寒沙門菌調控功能暫不清楚[7]?！颈狙芯壳腥朦c】STM0859基因屬于LysR家族的轉錄調節因子，然而，STM0859具體的生物學功能尚不清楚?！緮M解決的關鍵問題】為探究STM0859基因的功能，本研究對鼠傷寒沙門菌SL1344菌株STM0859基因進行克隆、編碼蛋白分子特征和遺傳進化分析，為進一步探討STM0859對ST生長特性、環境應激、耐藥性和毒力的調控作用奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基及試劑

ST SL1344強毒株和大腸桿菌(E.coli)DH5α由石河子大學預防獸醫學實驗室保存。LB肉湯瓊脂培養基購自北京奧博星生物技術有限公司；DL-2000 DNA Marker、pMD19-T(simple)載體購自TaKaRa公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自諾維森生物公司。

1.2 引物設計與合成

根據GenBank登錄的STM0859基因序列(登錄號：FQ312003.1)設計擴增STM0859基因上游引物STM0859F5′-GGAATTCATGCACTTTGATATAAAAG ATTTA-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)，下游引物STM0859R5′-CCTCGAGTCACTCAGTCTGAGCT GTGAG-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)，由北京華大基因公司合成。

1.3 ST STM0859基因的擴增、克隆及測序

挑取ST-SL1344單菌落于LB培養基中，置于37 ℃水平搖床培養15 h，按照細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取ST-SL1344分離株基因DNA，以DNA為模板，分別以STM0859F和STM0859R為引物PCR 擴增出STM0859基因，PCR的反應體系為：H2O 7 μl，PCR Mixture 10 μl，上下游引物各0.5 μl，DNA模板2 μl。反應條件為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中進行電泳，與Marker DL-2000相比，將目的片段用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，并與pMD19-T(simple)載體4 ℃連接，轉化DH5α感受態細胞，通過PCR篩選陽性菌克隆，送至華大基因公司測序。

1.4 STM0859基因及其編碼蛋白質的分子特征分析

利用ProtParam在線軟件( http://web.expasy.org/protparam/)計算蛋白質的理論分子質量、理論等電點；通過Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質的親水性與疏水性；利用PrositeScan(https://prosite.expasy.org/prosite.html)分析蛋白的結構域；通過SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行蛋白質的信號肽預測；利用DNAStar軟件預測STM0859蛋白的二級結構，應用SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)預測蛋白質的三級結構。

1.5 STM0859基因核苷酸序列遺傳進化分析

將ST-SL1344STM0859基因與GenBank已知的10多株ST不同菌株及其他種屬細菌的LysR家族轉錄調節基因核苷酸序列進行對比，應用MEGA5.0軟件對STM0859基因核苷酸序列進行遺傳進化分析，并采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 STM0859基因的擴增、克隆及測序

用STM0859F與STM0859R引物擴增STM0859基因，產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約891 bp的目的條帶(圖1)。PCR產物與pMD19-T(simple)載體連接，轉化到DH5α后通過菌液PCR篩選陽性克隆(圖2)，對陽性克隆進行測序分析，結果顯該基因與GenBank中預期的STSTM0859基因片段大小一致。

2.2 STM0859基因核苷酸及編碼氨基酸序列分析

由圖3測序結果顯示，ST-SL1344STM0859基因全長891 bp，編碼296個氨基酸；通過Motif Scan 在線軟件分析發現含1個N-糖基化位點(151aa～154aa); 6個酪蛋白激酶II磷酸化位點(61aa～64aa,137aa～140aa,171aa～174aa, 184aa～187aa,>195aa～198aa,257aa～260aa);6個蛋白激酶C磷酸化位點(35aa～37aa, 53aa～55aa,65aa～67aa，164aa～166aa，266aa～268aa，284aa ～286aa); 5個N-豆蔻?；稽c(23aa～28aa,56aa～61aa, 146aa～151aa,224aa～229aa);1個酪氨酸激酶磷酸化位點：(22aa～28aa); 1個LysR家族底物結合域(90aa～293aa)1個由螺旋-轉角-螺旋構成的HTH結構域(5aa～64aa)1個Orn/Lys/Arg脫羧酶C-末端結構域(21aa～83aa)。

2.3 STM0859蛋白分子特征分析

在線軟件分析發現，ST-SL1344株STM0859基因編碼蛋白分子量為33.6 kDa，等電點為7.83，其中Leu (L)含量最豐富(11.1 %)。疏水性平均數為-0.074，為親水性蛋白。SignalP 4.0 Server分析顯示，STM0859蛋白無信號肽序列；TMHMM 2.0 Server分析顯示，STM0859蛋白不存在跨膜區。與大腸桿菌和不動桿菌LysR家族轉錄調控因子相比，三者在其N端均具有1個H-T-H超二級結構域(圖4)，在C端有1個PBP2配體結合域，不動桿菌在N端還具有一個RbcR結構域，提示不同的細菌LysR家族蛋白成員在分子特征上存在一定的差異。

2.4 STM0859蛋白的高級結構分析

高級結構分析表明，STM0859含有α-螺旋(54.05 %)、β-折疊(6.76 %)無規則卷曲(21.28 %)和延伸鏈(17.91 %)組成。SWISS-MODEL預測該蛋白含有2個α-螺旋和2個β-折疊，形成了螺旋-轉角-螺旋結構域 (圖5～6)。

2.5 STM0859基因序列的遺傳進化分析

與GenBank上18株不同來源的細菌LysR家族相應的同源基因相比，ST SL1344株與ST 14028S親緣性最高，位于同一小分支；與腸道沙門氏菌腸道亞種PNCS009887、PNCS01484、CVM N26626及SC-B671株親緣性相對較近，但與R8-34041和ST1141等株親緣性較遠；與雞腸炎血清型str.287/911株、大腸桿菌str.K-12亞群MG 1655株、沙雷氏菌 AS13株親緣關系最遠，位于不同的分支上(圖7)，提示STM0859基因在ST菌株間具有高度的保守性，在屬間具有相對保守性。

3 討 論

ST是一種重要的食源性人獸共患菌，該菌可通過巨噬細胞吞噬進入宿主細胞，并在胞漿內寄生的革蘭氏陰性菌。該菌在完成吞噬小體逃逸、胞內生存、繁殖和細胞間擴散過程中需要多種毒力因子和轉錄因子的參與。轉錄因子(Transcription，TF)是一類能夠結合在特定基因上游特異核苷酸序列上的蛋白，并能調控該基因的轉錄。轉錄因子在分子結構上通常含有DNA結合結構域(DBD)、效應結構域(TAD)與配體結合域(LBD)等[8]。研究發現，LysR家族蛋白含有上述結構域，屬于轉錄因子，可調控許多病原微生物的基因表達。然而，LysR家族成員眾多，其特定的生物學功能需要深入研究[9]。

現有的研究發現，LysR一般由約300個氨基酸組成，N端都包含一個螺旋-轉角-螺旋基序，構成保守的DNA結合結構域[10-11],C端則為相對變異的協同因子作用區域，大部分LysR家族成員的該區域可結合一個來自于環境或代謝產生的小分子誘導劑或阻遏物，從而激活或抑制目標基因表達。本研究顯示，STM0859屬于LysR家族成員。有研究顯示，LysR家族蛋白在不同的培養基和不同培養環境中表達量差異顯著，可能與細菌能量代謝、環境應激、耐藥性和毒力的調控相關。在大腸桿菌中，K-12 LTTRs調節氮源利用、氨基酸生物合成和分解代謝、氧化應激反應和細胞解毒[12-13]。BenM和CatM LTTRs可影響不動桿菌ADP1菌株芳香族化合物的降解[14-15]。鼠疫耶爾森菌的RovM、銅綠假單胞菌PA14的MvfR和霍亂弧菌的AphB均與毒力有關[16-19]。 Sheehan 等(2015)研究布魯氏菌LysR家族成員VtlR轉錄調節因子發現，VtlR控制流產布魯氏菌小RNA編碼基因abcR2的表達，而流產布魯氏菌的野生型毒力需要兩個小RNA，AbcR1和AbcR2，表明LysR轉錄調節因子在布魯氏菌中與其毒力調控有關。Manman 等(2019)研究惡臭假單胞菌菌LysR家族成員GcdR發現，GcdR通過抑制谷胱甘肽羥基化途徑中2個關鍵基因csiD和lhgO的轉錄，激活谷胱甘肽coa脫氫途徑中兩個關鍵基因gcdH和gcoT的轉錄，調節谷胱甘肽的分解代謝反應。Fu等(2019)利用western blot和基因缺失技術證實LysR家族蛋白在抗藥性治療后在嗜水氣單胞菌中表達下調，提示LysR家族成員參與了細菌耐藥性的調控作用。

目前，鼠傷寒沙門菌STM0859的生物學功能尚不清楚。本研究首次克隆了ST SL1344強毒株轉錄因子STM0859基因，并對其分子結構特征進行分析，證實STM0859屬于LysR家族轉錄調節因子。同源性分析顯示，ST SL1344株STM0859基因與ST-14028S、ST-FDAARGOS_317、ST-TW-Stm6等菌株同源性很高，表明該基因在ST菌株間高度保守。與腸炎沙門氏菌亞種、雞腸炎血清型str.287/91與大腸桿菌str.K-12亞群MG1655親緣關系較遠。STM0859蛋白含有螺旋-轉角-螺旋結構域，推測其可與ST某些基因的順式作用元件DNA序列結合而發揮調控作用，為深入研究該蛋白在ST能量代謝、環境應激、耐藥性和毒力的調控作用奠定了前期基礎。

4 結 論

通過對鼠傷寒沙門菌STM0859基因生物信息學分析，其屬于LysR家族，該家族蛋白與細菌能量代謝、環境應激、耐藥性和毒力的調控相關，因此STM0859基因可能參與了ST毒力、環境應激等過程，STM0859基因在ST菌株間具有高度的保守性，在屬間具有相對保守性。研究結果為深入研究該蛋白在ST能量代謝、環境應激、耐藥性和毒力的調控作用奠定了前期基礎。