朝鮮薊莖葉中脂溶性提取物對神經細胞的保護作用

班齡尹，王笑園，龐思成，代毓敏，李景明，侯彩云

（中國農業大學食品科學與營養工程學院 北京100083）

朝鮮薊【Cynara cardunculus L.var.scolymus（L.）Fiori】為菊科菜薊屬多年生草本植物，主要種植于地中海地區，起源于野生多年生的野生型刺菜薊【Cynara cardunculus L.var.sylvestris（Lamk）Fiori】[1]，是一種富含營養物質的保健蔬菜，被認為是一種功能性食品[2]，具有緩解肝膽疾病及消化不良、抗氧化、抗菌、抗癌等多種生理功能活性。朝鮮薊的可食部分為內部苞片及花托，不可食用的工業副產物部分包括其外部苞片及莖葉，占整個植株鮮重的80%左右[2-3]，造成大量的土地占用、資源浪費及環境污染，因此對朝鮮薊莖葉副產物的開發利用尤為重要。

萜類化合物是異戊二烯聚合物及其衍生物的總稱，而倍半萜化合物及三萜化合物是朝鮮薊中主要的親脂類化合物。Ramos 等[4]從刺菜薊【Cynara cardunculus L.var.Altilis（DC）】中提取了脂溶性成分并對其組分進行系統分析，其中去?；怂E苦素、羽扇豆醇醋酸酯、Ψ-蒲公英甾醇醋酸酯在栽培型刺菜薊中均為第1 次報道。有文獻表明，萜類化合物具有抗高血脂[5]、抗炎[6]、抗癌[7]等生理活性，然而截至目前，對朝鮮薊副產物中萜類化合物的開發利用及相關活性的研究較少，對于其神經保護作用的報道更是不足。

大量研究表明，氧化應激誘導的神經細胞損傷與多種神經退行性疾病有關，如阿爾茲海默癥和帕金森病等[8-11]。在神經退行性疾病中，活性氧引起的氧化應激被廣泛認為是神經細胞損傷的主要原因之一[12-13]?，F普遍認為，對中樞神經系統退化的有效治療方法是保護神經細胞免受氧化損傷[14-15]。有大量研究證明，許多天然抗氧化物都具有神經保護作用[16-20]。

本研究采用GC-MS 分析朝鮮薊副產物脂溶性提取物中萜類及甾醇類化合物的組成與含量，通過測定不同指標研究脂溶性提取物對神經細胞的保護作用，為朝鮮薊副產物的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

朝鮮薊（Cynara scolymus L.）的莖葉等副產物于2018年4月份采自于中國云南省曲靖市陸良縣中樞鎮華僑農場，采收后當天立即空運送往實驗室，液氮冷凍干燥、粉碎，過50 目篩，裝于自封袋中，于-20℃冰箱中保存。

正構烷烴（C7～C40），上海安普實驗科技股份有限公司；正十六烷（純度＞99.5%）、吡啶（純度＞99.9%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；菜薊苦素（純度96.4%）、豆甾醇（純度98%）、β-谷甾醇（純度95%）、羽扇豆醇（純度98%），天津阿爾塔科技有限公司；α-香樹脂醇（純度≥98%）、β-香樹脂醇（純度≥98%）、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒，美國Sigma-Aldrich 公司；三甲基氯硅烷（純度＞99%）、N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（純度96%）、二氯甲烷（分析純級），上海麥克林生化科技有限公司；30% H2O2溶液，國藥集團化學有限公司；RPMI1640 培養基、青霉素-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶，美國GIBCO 公司；胎牛血清，美國HYCLONE 公司；二甲基亞砜（DMSO）、PBS 緩沖液、DPBS 緩沖液、CCK8 試劑盒、DCFH-DA 試劑盒、吖啶橙-溴化乙錠（AO-EB）試劑盒，索萊寶生物科技有限公司；脂質氧化（MDA）試劑盒、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒，碧云天生物技術有限公司。

1.2 主要儀器與設備

6890N/5973 氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫科技公司；BD FACSEALIBUR 型流式細胞儀，美國BD 公司；YG-XD 30 型熒光顯微鏡，中國PVD 公司；Tis 型倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司；Infinite F50 型酶標儀，澳大利亞TECAN 公司。

1.3 脂溶性物質的提取

參考Romas 等[4]的方法并稍作修改。準確稱取朝鮮薊副產物凍干粉5 g，加入125 mL 二氯甲烷，索氏提取7 h，利用旋轉蒸發儀在50℃下對提取液進行低壓干燥，旋蒸后加入二氯甲烷對干燥后的提取物進行復溶，定容至25 mL，取1 mL 氮吹至徹底干燥，于-20℃冰箱中保存。

1.4 GC-MS 分析

參考Romas 等[4]的方法并稍作修改。在進行GC-MS 檢測之前，先進行三甲基硅烷化（TMS）衍生，向氮吹干燥后的脂溶性提取物中加入250 μL含1 mg 正十六烷（內標）的吡啶，待提取物完全溶解后，加入250 μL 的N，O-雙（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺和50 μL 的三甲基氯硅烷，混合物于70℃反應30 min。

氣相色譜-質譜聯用儀配以DB-5 J＆W 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國安捷倫科技公司），載氣為高純氦氣（41 cm/s）。色譜的操作條件為：自動進樣，進樣量1 μL，進樣口溫度270℃，分流比30∶1。柱溫箱的升溫程序為：初始溫度120℃，保持2 min，以4℃/min 的速度升至250℃，而后以2℃/min 的速度升至285℃，并保持15 min。質譜的操作條件為：離子碰撞模式，離子能量70 eV，以全掃描模式進行信息采集，掃描范圍為m/z 30～600，離子源溫度230℃。

GC-MS 色譜圖的處理軟件采用MSD Chem-Station 工作站（Agilent，Version E02）。定性時，通過將色譜峰的質譜信息與相關文獻及工作站所匹配的NIST 質譜庫進行比較，必要時通過標樣定性。定量時，主要的萜類及甾醇類化合物通過標曲定量，其余化合物通過內標（正十六烷）定量，結果均折算為樣品中物質的含量，用mg/kg DM 表示。

1.5 細胞培養

參考Tang 等[21]的方法并稍作修改。將PC12細胞用完全培養基（RPMI 1640 培養基，10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素）接種于6 孔板中，接種密度3×105 個/mL，接種量2 mL/孔，置于37℃，5%CO2的水套式CO2 孵育箱中培養24 h。

1.6 細胞活力的測定

將PC12 細胞用完全培養基接種于96 孔板中，接種密度3×105個/mL，接種量100 μL/孔，于37℃，5% CO2的孵育箱中培養24 h。用不完全培養基（RPMI 1640 培養基，2%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素）將脂溶性提取物稀釋至高、中、低3 個不同的質量濃度，分別處理PC12 細胞8 h 后，加入含90 μmol/L H2O2的不完全培養基培養4 h。與預保護后傷害組相對應，以未經脂溶性提取物保護、經H2O2傷害的PC12 細胞作為模型組，以未經H2O2傷害、經高濃度脂溶性提取物處理的PC12 細胞作為脂溶性提取物保護組，以未經任何處理的PC12 細胞作為空白對照組，利用CCK8 法檢測每孔中細胞的存活率，參考Ding 等[22]的方法，將處理后的細胞移除培養基，加入100 μL/孔配好的CCK8 工作液，置于5% CO2 的孵育箱中，37℃孵育2 h，酶標儀檢測橘黃色甲臜的生產量，檢測波長450 nm 處的吸光度值，每組做6 個平行。

1.7 乳酸脫氫酶（LDH）漏出率檢測

細胞培養基中的LDH 含量是衡量細胞損傷程度的重要指標，對按照1.5 節方法培養好的細胞進行4 組不同處理后，收集每孔中的培養基，按照試劑盒說明書檢測培養基中LDH 活性。

1.8 抗氧化活性的測定

氧化應激會直接或間接導致ROS 介導的核酸、蛋白質和脂質損傷，并且涉及癌變[23]、神經退行性病變[24]、動脈粥樣硬化、糖尿病[25]和衰老[26]等。在神經退行性疾病中，活性氧（ROS）引起的氧化應激被廣泛認為是神經細胞損傷的主要原因之一，本研究利用2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）探針檢測細胞內ROS 水平。對按照1.5 節方法培養好的細胞進行脂溶性提取物處理組、模型組、空白對照組3 組處理后，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化細胞，于4℃，1 500 r/min 離心3 min 后使用完全培養基洗滌細胞，按照1∶1 000 比例用無血清培養基（RPMI1640培養基，1%青霉素-鏈霉素）稀釋DCFH-DA，取0.5 mL 稀釋液加入細胞，于CO2 孵育箱中避光孵育20 min，使用無血清培養基洗滌細胞3 次，用熒光顯微鏡觀察細胞熒光情況，并用流式細胞儀量化檢測，檢測條件為激發波長488 nm，發射波長605 nm。對按照1.5 節方法培養好的細胞進行4組處理后，按照試劑盒說明書對細胞內丙二醛（MDA）水平進行檢測，來確定脂質氧化的水平。

1.9 細胞凋亡的測定

對按照1.5 節方法培養好的細胞進行預保護后傷害組、模型組、空白對照組3 組處理后，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化收集細胞，杜氏磷酸緩沖液（DPBS）洗滌細胞2 次，加入500 μL 去離子水稀釋好的結合緩沖液（1×）重懸細胞，上機前加入5 μL 膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和10 μL 碘化丙啶（PI），室溫避光反應10 min，細胞流式儀量化檢測，檢測條件為激發波長488 nm，發射波長530 nm。對按照1.5 節方法培養好的細胞進行預保護后傷害組、模型組、空白對照組3 組處理后，向每個細胞處理組的培養基中加入40 μL AO-EB 染液，室溫放置5 min，熒光顯微鏡拍照觀察。

2 結果和討論

2.1 朝鮮薊副產物的中萜類及甾醇類化合物

倍半萜烯類化合物及三萜是朝鮮薊中主要的親脂類化合物。倍半萜烯類化合物主要集中分布在葉片中，在莖干以及花蕾中含量較少，相反，三萜類化合物在葉片中含量較低[4，27]。本試驗共鑒定出13 種萜類及甾醇類化合物，其中包括3 種倍半萜內脂、2 種甾醇及8 種五環三萜（表1）。

由表1可知，朝鮮薊副產物中愈創木烷型倍半萜內脂主要包括菜薊苦素、去?；怂E苦素和大海米菊素。菜薊苦素是朝鮮薊副產物中主要的倍半萜內脂，也是朝鮮薊中一種主要的苦味成分，被視為朝鮮薊類植物的化學分類標志[28]，在朝鮮薊中含量高達13 309.10 mg/kg DM，占總萜類及甾醇類化合物的64.90%，占總倍半萜內脂的82.18%。研究表明菜薊苦素具有抗光老化[29-30]、抗痙攣[31]、抗高血脂[32]等藥理作用。

表1 朝鮮薊副產物脂溶性提取物中萜類及甾醇類化合物定性及定量Table 1 Qualitative and quantitative analysis of terpenoids and sterols in lipophilic extract from by-product of artichoke

朝鮮薊莖葉副產物中豆甾醇含量為264.67 mg/kg DM，β-谷甾醇含量為586.67 mg/kg DM，均屬于甾醇類化合物。植物甾醇是一種天然的植物活性物質，是植物細胞膜的組成部分，具有較強的抗炎、降低膽固醇及預防動脈粥樣硬化等功效，而β-谷甾醇在減少血清膽固醇吸收方面作用顯著，在減少冠心病及控制腫瘤生長方面起著重要作用。

五環三萜類物質是朝鮮薊副產物脂溶性提取物中含量較高的一類，占總萜類及甾醇類化合物的16.88%，其結構主要分為羽扇豆烷型、蒲公英甾烷型和齊墩果烷型。其中，蒲公英甾烷型含量最高，占五環三萜總含量的58.93%，并且其兩種醋酸酯衍生物的總量為1 184.08 mg/kg DM，高于蒲公英甾醇和Ψ-蒲公英甾醇的總量（855.53 mg/kg DM），蒲公英甾醇和Ψ-蒲公英甾醇及其醋酸酯衍生物曾在朝鮮薊的花蕾中檢測出，具有顯著的抗炎活性[33]；羽扇豆醇含量為423.06 mg/kg DM，Noldin 等[34]也曾在朝鮮薊中發現羽扇豆醇，該化合物已被證實具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗關節炎及免疫調節功能[35]。齊墩果烷型五環三萜主要為α-香樹脂醇、β-香樹脂醇及β-香樹脂醇醋酸酯，其中醋酸酯衍生物的含量為535.86 mg/kg DM，高于兩種醇的含量，這與Romas 等[4]在刺菜薊（栽培型）的不同形態部位中得到的結果一致。Piccolella 等[36]在乳香黃連木（Pistacia lentiscus L.）葉片的提取物中發現了羽扇烷醇、羽扇豆醇、β-香樹脂醇、羽扇豆烯酮等萜類化合物，并且其粗提物具有預防或治療神經母細胞瘤的潛在功能。

2.2 PC12 細胞的細胞活力

利用CCK8 法對細胞活力進行檢測。細胞存活率受脂溶性提取物質量濃度和處理時間的影響（圖1），低質量濃度（0.25 mg/L）下處理PC12 細胞，細胞存活率不受影響；隨著脂溶性提取物質量濃度的增加（0.5～2 mg/L），PC12 細胞存活率顯著提高，并呈現質量濃度依賴性，其中2 mg/L 的脂溶性提取物對細胞的保護作用最強，處理24 h后，存活率達到138.26%；然而，當利用高質量濃度的脂溶性提取物（8 mg/mL）處理細胞時，呈現出明顯的質量濃度時間依賴性傷害作用。因此，選擇0.5，1，2 mg/L 3 個質量濃度進行后續試驗。

圖1 朝鮮薊副產物脂溶性提取物對PC12 細胞存活率的影響Fig.1 Effects of lipophilic extract of artichoke by-product on the cell viability of PC12 cells

與空白對照組相比，90 μmol/L H2O2處理PC12 細胞4 h 后，細胞存活率為48.05%（圖2）。經脂溶性提取物預處理后，H2O2對PC12 細胞的損傷作用受到顯著抑制（P＜0.01），其中2 mg/L 的脂溶性提取物預處理細胞8 h 后，細胞存活率達到66.90%，因此在一定質量濃度范圍內，脂溶性提取物都可以顯著保護PC12 細胞免受H2O2 的損害作用。

圖2 朝鮮薊副產物脂溶性提取物預處理對H2O2誘導損傷的PC12 細胞存活率的影響Fig.2 Effects of pretreatment with lipophilic extract of artichoke by-product on the cell viability of H2O2-induced PC12 cells

2.3 PC12 細胞的LDH 漏出率

為了對脂溶性提取物的保護作用做進一步研究，檢測了PC12 細胞的LDH 漏出率，即溶解細胞中釋放出的乳酸脫氫酶的含量，用該指標評價細胞膜的受損程度。與空白對照組相比，90 μmol/L H2O2處理PC12 細胞4 h 后，其LDH 漏出率顯著增大（P＜0.01），達到194.69%（圖3）；經脂溶性提取物預處理后，PC12 細胞的LDH 漏出率與模型組相比有顯著降低（P＜0.01），其中，2 mg/L 脂溶性提取物預處理細胞8 h 后，LDH 漏出率為110.28%，因此脂溶性提取物可以顯著地緩解H2O2對神經細胞的損害作用。

圖3 朝鮮薊脂溶性提取物預處理對H2O2 誘導的PC12 細胞LDH 漏出率的影響Fig.3 Effects of pretreatment with lipophilic extract of artichoke by-product on the cell LDH release of H2O2-induced PC12 cells

2.4 PC12 細胞中的ROS 水平及MDA 含量

ROS 主要來源于損傷的線粒體[39]，當細胞內產生過量的ROS 或體內氧化劑含量超過細胞的抗氧化應答能力時，細胞就會產生氧化應激[40]。本試驗以DCFH-DA 作為熒光探針，檢測2′，7′-二氯熒光素（DCF）的熒光強度即可獲知細胞內ROS的水平。與空白對照組相比，90 μmol/L H2O2處理PC12 細胞4 h 后，細胞內ROS 水平顯著增加（P＜0.01），達到460.43%（圖4a），使細胞產生嚴重的氧化損傷；經脂溶性提取物預處理后，能夠顯著地抑制PC12 細胞內ROS 的產生（P＜0.01），其中2 mg/L 脂溶性提取物預處理細胞8 h 后，ROS 含量為208.37%。熒光顯微鏡觀察染色后的PC12 細胞發現，細胞呈現的熒光強度變化與細胞內ROS 水平變化趨勢一致（圖4b）。因此，脂溶性提取物可以有效地清除ROS，緩解H2O2引發的線粒體功能障礙。

圖4 朝鮮薊脂溶性提取物預處理對H2O2 誘導的PC12 細胞內ROS 水平的影響Fig.4 Effects of pretreatment with lipophilic extract of artichoke by-product on the intracellular ROS level of H2O2-induced PC12 cells.

當動物或植物體產生氧化應激時，會發生脂質氧化，而MDA 是一種生物體脂質氧化的天然產物，可以用來確定脂質氧化水平。與空白對照組相比，90 μmol/L H2O2處理PC12 細胞4 h 后，MDA含量顯著增多（P＜0.01），達到192.98%（圖5）；經脂溶性提取物預處理8 h 后，能夠顯著地阻止MDA 的產生（P＜0.01）；而正常細胞經脂溶性提取物處理后，在無H2O2傷害的情況下，其MDA 含量可降低至25.71%。

圖5 朝鮮薊脂溶性提取物預處理對H2O2誘導的PC12 細胞內MDA 含量的影響Fig.5 Effects of pretreatment with lipophilic extract of artichoke by-product on the intracellular MDA production of H2O2-induced PC12 cells

2.5 脂溶性提取物對PC12 細胞凋亡的影響

為了進一步探究脂溶性提取物能否有效地抑制細胞凋亡，利用Annexin V-FITC/PI 進行染色，經流式細胞術檢測細胞凋亡率（圖6a）。如圖6b所示，與空白對照組（8.14%）相比，H2O2處理顯著增加了細胞凋亡率（23.66%），經朝鮮薊脂溶性提取物預處理后，PC12 細胞的凋亡得到顯著抑制。其中，經過2 mg/L 脂溶性提取物預保護后，細胞凋亡率降低至8.75%。

為了更加直觀地比較不同處理組的細胞凋亡情況，利用AO-EB 對細胞進行染色，通過熒光顯微鏡觀察細胞形態。如圖6c所示，空白對照組的細胞因為吖啶橙（AO）透過其完整的細胞膜嵌入DNA，幾乎全部呈現綠色熒光，細胞形態正常，沒有明顯的凋亡相關形態學改變；經H2O2處理的模型組的細胞發生了邊緣化、核凝集等發綠色熒光的早期凋亡現象，并且因為溴化乙錠（EB）透過其破損的細胞膜嵌入DNA，呈現出橘黃色熒光的晚期凋亡現象；而經過朝鮮薊脂溶性提取物預處理的PC12 細胞呈現出早期凋亡和晚期凋亡細胞皆有減少的現象，并呈現質量濃度依賴性。

圖6 朝鮮薊脂溶性提取物預處理對H2O2 誘導的PC12 細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of pretreatment with lipophilic extract of artichoke by-product on cell apoptosis of H2O2-induced PC12 cells

3 結論

本試驗探究了朝鮮薊副產物中脂溶性提取物對PC12 神經細胞的保護作用。利用GC-MS 對朝鮮薊副產物中萜類及甾醇類化合物進行定性與定量分析，結果表明，主要含有3 種倍半萜內脂，2種甾醇及8 種五環三萜。試驗以H2O2 作為氧化損傷誘導劑，探究朝鮮薊副產物脂溶性提取物的生理活性，發現該提取物可降低PC12 神經細胞的氧化損傷，并且伴隨細胞內LDH 漏出率、MDA 含量及ROS 水平的降低。經過Annexin V-FITC/PI 雙染及AO-EB 雙染后發現，經脂溶性提取物處理的PC12 細胞凋亡率顯著降低，與熒光顯微鏡的觀察結果一致。綜上，朝鮮薊副產物脂溶性提取物對PC12 神經細胞具有抗凋亡及保護作用，值得進一步的開發利用與研究。