植物多酚與鰱魚肌球蛋白相互作用及其對肌原纖維蛋白結構和凝膠形成的影響

裘樂蕓，邢 倩，鄧澤元，鄭溜豐

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室 南昌330047）

我國水域遼闊，生物資源豐富，是世界上漁業資源最豐富的國家，其中淡水魚養殖產量占世界總產量的50%以上。近年來，魚糜制品（包括魚丸、魚糕和魚卷等）作為一類富含優質蛋白質、口感嫩爽、食用方便的低膽固醇健康食品，其產量和市場需求逐年增加，是我國水產加工產業的重點發展環節[1]。然而，魚糜制品主要以海洋魚類為原料，較少使用淡水魚，主要原因是淡水魚糜普遍存在凝膠強度差、凝膠易劣化等問題，限制了我國淡水魚糜制品加工產業的發展。如何通過科學手段提高淡水魚糜的凝膠特性，是現代水產品加工的重要科學問題。

加熱是魚糜制品加工的關鍵環節。水浴加熱是我國生產魚糜制品的傳統加熱方式，其熱量由魚糜外部向內部緩慢傳遞，導致凝膠在50～70℃停留時間過長，加劇凝膠劣化程度[2]。近年來，微波加熱由于具有加熱速度快、物料受熱均勻以及熱轉換效率高等諸多優點，廣泛應用于蔬菜、水果和肉制品的保鮮和深加工中[3]。與水浴加熱相比，微波加熱縮短了凝膠劣化的時間，肉制品表現出更好的凝膠形成和持水能力[4]。目前國內外部分研究表明微波加熱代替水浴加熱能夠明顯提高魚糜的凝膠強度與持水能力[5]。

天然植物多酚尤其是茶多酚，因具有抗菌、抗炎、抗過敏、抗慢性病、抗癌等生理功效而受到關注，被廣泛用于抑制肉制品的脂肪氧化及保鮮[6]。蛋白質變性伸展是高溫誘導魚糜凝膠形成的必要條件[7]。除作為天然抗氧化劑外，茶多酚可與蛋白質相互作用，修飾蛋白質側鏈氨基酸功能基團，改變蛋白質結構及功能特性[8-9]。國外研究表明，向魚糜中添加氧化酚類化合物或從天然產物中提取的單寧類物質，能夠顯著提高魚糜凝膠的破斷強度和凹陷深度[10]。EGCG 是綠茶茶多酚的主要組成成分，以微波為加熱方式，添加EGCG 是否能改善淡水魚糜的凝膠特性及其機理有待探究。

肌原纖維蛋白是肌肉的基本組成單位，其中肌球蛋白是最重要的功能蛋白，對魚糜凝膠的形成起關鍵作用[11-12]。本研究通過同源建模構建鰱魚肌球蛋白的三維結構，利用分子對接技術探究3種常見植物多酚【表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、山奈酚、槲皮素】與肌球蛋白的結合能力及位點，進一步研究EGCG 與肌球蛋白的結合對整個肌原纖維蛋白二級結構和聚集行為的影響及添加EGCG 并微波加熱對肌原纖維蛋白凝膠特性的改善作用，旨在為開發具有理想凝膠特性的淡水魚糜制品提供試驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚，購于南昌市江大南路農貿市場，現殺去骨后運至實驗室。

綠茶提取物（EGCG 50.00%，咖啡因0.65%），陜西嘉禾生物公司；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、二丁基羥基甲苯（BHT），鄭州康本生物有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型），上海碧云天生物技術有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒，博士德生物工程有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），上海生工生物工程有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；氯化鈉、氯化鉀等試劑均為國產分析純級。

1.2 設備與儀器

TDL-5-A 低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；SHZ-A 水浴恒溫振蕩器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；VS-25S 手持勻漿器，無錫沃信儀器制造有限公司；DYCZ-24DN 迷你雙垂直電泳儀，北京六一儀器廠；BROOKFIELD CT3 質構儀，美國博勒飛公司；凝膠成像儀1600R，上海天能科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取 將鰱魚的白色肌肉切碎，于碎肉機中制成肉糜。加入5 倍體積的低鹽緩沖液（含0.05 mol/L NaCl 及20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），12 000 r/min 勻漿3 次，每次20 s，間隔20 s，在8 000×g、4℃條件下離心10 min，取沉淀，重復3 次。在沉淀中加入5 倍體積的高鹽緩沖液（含0.045 mol/L NaCl 及20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），12 000 r/min 勻漿3 次，每次20 s，間隔20 s，在8 000×g、4℃條件下離心10 min，取上清液并加入去離子水，在4℃下沉淀30 min，沉淀即為肌原纖維蛋白[13]。采用BCA 試劑盒的方法測定蛋白質濃度。

1.3.2 EGCG 修飾肌原纖維蛋白 將肌原纖維蛋白沉淀配成60 mg/mL 溶液，加入不同質量的EGCG 使溶液EGCG 質量濃度分別為0.125，0.25，0.375，0.5，0.75，1 mg/mL，攪拌混勻后，25℃水浴振蕩90 min[14]。振蕩結束后樣品于4℃下保存，3 d內使用。

1.3.3 蛋白質的SDS-PAGE 分析 采用SDSPAGE 分析EGCG 修飾前、后肌原纖維蛋白的分子質量分布。蛋白樣品加入上樣緩沖液后于95℃加熱10 min 使蛋白變性。采用10%的分離膠及5%的濃縮膠進行凝膠電泳，電泳結束后進行考馬斯亮藍染色，脫色后使用凝膠成像儀成像。

1.3.4 水浴加熱制備蛋白凝膠經EGCG 修飾后，采用兩段式加熱法制備肌原纖維蛋白凝膠，即低溫凝膠化（40℃下水浴30 min）及高溫魚糕化（90℃下水浴30 min）。加熱結束后立即在冰水浴中放置60 min 以充分形成凝膠，儲存于4℃，并于1 d 內進行凝膠測試。

1.3.5 微波加熱制備蛋白凝膠經EGCG 修飾后，在40℃下水浴30 min 后，微波加熱60 s，使溫度維持在90℃左右，功率150 W。為防止微波高溫加熱過度導致水分大量損失，分3 次加熱，每次20 s，間隔20 s[15]。加熱結束后立即在冰水浴中放置60 min 以充分形成凝膠，儲存于4℃，并于1 d內進行凝膠測試。

1.3.6 凝膠的質構測定 制備的凝膠于室溫平衡2 h 后，用BROOKFIELD CT3 質構分析儀測定凝膠的穿刺性能，將凝膠切成高25 mm 的小圓柱體，斷面的中心置于質構儀探頭的正下方樣品臺上，選用球形探頭P/5S（直徑5 mm），進行1 次壓縮，測試前速度2 mm/s，測試中速度1 mm/s，測試后速度10 mm/s，壓縮距離15 mm，觸發力5 g，數據采集速度100 Hz。每個處理組測4 次。測試過程中的最大力即為破斷強度，對應的壓縮距離為凹陷深度，凝膠強度等于破斷強度與凹陷深度的乘積[16]。

1.3.7 肌球蛋白的同源建模及與幾種酚類化合物的分子對接

1）同源建模 由于鰱魚肌球蛋白的三維結構是未知的，因此通過同源建模構建該蛋白的三維結構。在NCBI 上搜索鰱魚的肌球蛋白氨基酸序列，采用同源模型服務軟件SWISS-MODEL 預測該肌球蛋白的三維結構，選擇相似度且評分最高的模型作為鰱魚肌球蛋白的三維晶體結構。利用MolProbity 評價該三維結構模型的結構合理性，獲得拉氏構象圖[17]。

2）分子對接EGCG、山奈酚、槲皮素的分子結構從Automated Topology Builder 上下載。采用分子對接軟件AutoDockTools 對肌球蛋白與小分子化合物進行對接，使用Flexible Docking 模塊，計算配體與蛋白結合的活性位點及對接能，從100 次對接中選擇結合能量最低且次數最多的構象作為最佳結合姿態進行分析[18]。

1.3.8 肌原纖維蛋白的紅外光譜稱取4 mg 左右冷凍干燥的肌原纖維蛋白樣品和100 mg 溴化鉀粉末，研磨至樣品與溴化鉀均勻。用壓片機制成試片，取出試片置于紅外光譜儀內。設定參數為：掃描次數32 次，分辨率4 cm-1，掃描波數范圍4 000～400 cm-1，對反應體系紅外光譜圖的1 600～1 700 cm-1區采用傅里葉自去卷積和譜線擬合技術處理推測蛋白質二級結構的變化[19]。本文中的二級結構定量計算通過PeakFit 軟件完成。

2 結果與分析

2.1 鰱魚肌球蛋白的三維同源建模

根據鰱魚肌球蛋白的氨基酸序列，從SWISSMODEL 上尋找到一種與其高度相似且評分最高的蛋白三維結構模型，其中序列一致性（Identity）為74.12%，覆蓋率（Courage）為99%，序列相似性（Similarity）為52%，全局模型質量評估（GMQE）分數為0.52，滿足同源建模的標準，依此構建的三維結構模型見圖1。由圖1可知，該蛋白由輕鏈和重鏈組成，這是肌球蛋白典型的結構特點。

圖1 鰱魚肌球蛋白的三維結構Fig.1 Three dimensional model of the myosin from sliver carp

為進一步說明同源建模結果的合理性，通過在SWISS-MODEL 網頁上查看和下載建模后的結構特征圖，對肌球蛋白的三維結構進行驗證。由圖2a～c 可知，該三維結構模型趨于真實的蛋白質結構。此外，拉氏構象圖顯示，該三維結構模型有86.5%（824/953）的氨基酸位于有利區域，95.7%（912/953）的氨基酸位于可接受區域，僅有4.3%（41/953）的氨基酸位于不可接受區域（圖2d），故該三維蛋白結構模型可靠，可用于后續的分子對接研究。

圖2 鰱魚肌球蛋白三維結構模型的質量評價Fig.2 Quality evaluation of three dimensional model of the myosin from sliver carp

2.2 植物多酚與肌球蛋白的分子對接

選擇植物中含量豐富的3 種多酚（EGCG、山奈酚、槲皮素），分別下載其結構保存為PDB 格式文件，用Flexible Docking 進行分子對接試驗。將酚類化合物對接入鰱魚肌球蛋白的結合位點，結果見圖3～5。由圖可知，EGCG、山奈酚、槲皮素與肌球蛋白均存在較強的結合，對接能分別為-32.84 kJ/mol（-7.85 kcal/mol），-30.75 kJ/mol（-7.35 kcal/mol），-27.49 kJ/mol（-6.57 kcal/mol）。這3 種植物多酚與肌球蛋白的結合發生在同一區域，并且以氫鍵、疏水相互作用等非共價方式結合，其中EGCG 的結合能力最為顯著（對接能量最低）。雖然山萘酚只有一個氫鍵作用但結合能比槲皮素大，可能是因為范德華力和疏水作用力等更強所造成的[20]。因此，選擇EGCG 進行后續研究，探究其與肌球蛋白的相互作用對整個肌原纖維蛋白結構及聚集行為的影響。

圖3 EGCG 與鰱魚肌球蛋白的分子對接結果Fig.3 Molecular docking results of EGCG with myosin from sliver carp

圖4 山萘酚與鰱魚肌球蛋白的分子對接結果Fig.4 Molecular docking results of kaempferol with myosin from sliver carp

圖5 槲皮素與鰱魚肌球蛋白的分子對接結果Fig.5 Molecular docking results of quercetin with myosin from sliver carp

2.3 EGCG 修飾對鰱魚肌原纖維蛋白二級結構的影響

茶多酚與蛋白質的相互作用被廣泛關注，EGCG 是綠茶多酚中主要的功能活性成分，可通過與蛋白質形成氫鍵、疏水鍵等非共價鍵來影響蛋白質二級和三級結構，使蛋白質結構展開。相關研究主要集中在其對α-乳清蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白和血清白蛋白的結構和功能改性上[21-22]。肌球蛋白是肌原纖維蛋白的重要組成部分，為進一步探究EGCG 與肌球蛋白的相互作用是否影響整個肌原纖維蛋白的二級結構，通過傅里葉紅外光譜對肌原纖維蛋白的二級結構進行分析，如圖6所示。酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）主要來自C=O 和C-N 伸縮振動，其吸收峰與蛋白質二級結構對應如下：β-折疊1 610～1 640 cm-1，無規則卷曲1 640～1 650 cm-1，α-螺旋1 650～1 658 cm-1，β-轉角1 660～1 695 cm-1[23]。

圖6 不同劑量EGCG 修飾鰱魚肌原纖維蛋白后的紅外光譜Fig.6 FT-IR spectra of myofibrillar protein from sliver carp modified by different doses of EGCG

通過FTIR 分析EGCG 修飾或未修飾的肌原纖維蛋白的二級結構，結果見表1。加入EGCG 后肌原纖維蛋白的α-螺旋含量減少，β-轉角和無規則卷曲含量增加，且隨著質量濃度的增加呈先增大后減小的趨勢，說明EGCG 的添加使肌原纖維蛋白二級結構由α-螺旋結構向無規則卷曲和β-轉角結構轉化，提示EGCG 與肌球蛋白結合后可能對整個肌原纖維蛋白的二級結構有顯著影響。β-轉角和無規則卷曲的形成有利于后續高溫誘導蛋白質相互交聯，增大魚糜的凝膠強度[24]。此外，除非共價相互作用外，酚類化合物還可通過共價相互作用的方式與蛋白質發生結合[25]。在高溫條件下，植物多酚易被氧化形成醌類物質，其作為一種親電子物質極易進一步與蛋白質肽鏈的末端氨基以及賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸的游離氨基或巰基等共價結合[26]，而這些氨基酸在淡水魚肉中含量豐富[27]，提示植物多酚在高溫下易與淡水魚肌原纖維蛋白發生高程度的共價結合，從而促使蛋白凝膠網絡的形成。

2.4 EGCG 修飾對鰱魚肌原纖維蛋白聚集行為的影響

蛋白質變性伸展有利于其聚集形成網絡結構，圖7是用EGCG 修飾前、后的鰱魚肌原纖維蛋白的SDS-PAGE 電泳圖。對于肌原纖維蛋白原液，在220 ku 附近的明顯條帶為肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MHC），在45 ku 附近的明顯條帶為肌動蛋白（Actin，AC），而在18～22 ku 附近的明顯條帶為肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain，MLC）。未添加多酚但經過修飾過程的對照組（C組）與蛋白原液相比（M 組），蛋白條帶并沒有顯著差異。而TP 組和EGCG 組肌原纖維蛋白中MHC、AC、MLC 蛋白明顯減少，且在40 ku 和100 ku 附近有新的不連續條帶生成，說明含量減少的蛋白發生了聚集。

圖7 茶多酚和EGCG 修飾肌原纖維蛋白前、后的SDS-PAGE 電泳圖Fig.7 Electrophoresis patterns of myofibrillar protein from sliver carp before or after modification of tea polyphenols and EGCG

2.5 添加EGCG 對鰱魚肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

為了更好地將EGCG 應用于魚糜制品實際生產中，進一步探究添加EGCG 對高溫誘導鰱魚肌原纖維蛋白凝膠形成的影響。采用水浴或微波高溫加熱的方式制備鰱魚肌原纖維蛋白凝膠，其凝膠特性的結果見表2。與水浴加熱相比，微波加熱顯著提高了凝膠的破斷強度、凹陷深度及凝膠強度（P＜0.05）。在一項關于深海魚的研究中也發現了微波加熱可以顯著提高蛋白質的凝膠強度[28]。微波加熱能顯著改善魚糜凝膠特性的可能原因是：魚糜在加熱過程中溫度迅速升高且受熱均勻，減少了50～70℃時魚糜的凝膠劣化。因此，微波加熱下魚糜吸收相同或較少能量，能獲得較高的凝膠強度，優于水浴加熱[29]。在采用微波加熱方式制備凝膠的基礎上，添加0.125～1 mg/mL EGCG 均能進一步顯著改善肌原纖維蛋白的凝膠特性，且這種改善作用在添加量為0.5 mg/mL 時達到最大，其凹陷深度和凝膠強度分別增加了59.9%和89.8%，而添加高劑量的EGCG（1 mg/mL）反而降低了肌原纖維蛋白的凝膠特性。適量的EGCG 修飾對肌原纖維蛋白凝膠的改善作用可能與其通過酚羥基與蛋白質上的賴氨酰、半胱氨酰等氨基酸殘基的交聯密切相關[30]。

表2 不同加熱方式及添加EGCG 對鰱魚肌原纖維蛋白凝膠特性的影響Table 2 Effects of different heating methods and addition of tea polyphenols on gel properties of myofibrillar protein from sliver carp

植物多酚已被證明能通過抗氧化作用提高蛋白質的凝膠特性[31-32]。添加人工合成抗氧化劑BHT對微波誘導的魚糜蛋白凝膠形成的影響如圖8所示。添加0.5～2 mg/mL 的BHT 并不影響肌原纖維蛋白的凝膠強度。另外，利用分子對接技術也發現BHT 不能與肌球蛋白分子對接上，表明兩者間無法發生結合，推測植物多酚對肌原纖維蛋白凝膠特性的改善很可能不依賴于其抗氧化作用，而與其和肌球蛋白相互作用引起蛋白結構的改變密切相關。

圖8 添加不同質量分數BHT 對鰱魚肌原纖維蛋白凝膠強度的影響Fig.8 Effects of supplementation with different mass fraction of BHT on gel strength of myofibrillar protein from sliver carp

3 結論

試驗選取的3 種植物多酚（EGCG、山奈酚、槲皮素）均能與鰱魚肌球蛋白的同一區域發生較強的結合，并且結合方式為氫鍵、疏水相互作用等非共價鍵，其中EGCG 與蛋白的結合能力最強。EGCG 與肌球蛋白的相互作用能引起整個肌原纖維蛋白二級結構的改變，具體表現為α-螺旋含量降低，β-轉角及無規則卷曲含量增加，蛋白結構變得松散，有利于蛋白質之間發生聚集及凝膠的形成。添加0.125～1 mg/mL EGCG 并微波高溫加熱可以改善鰱魚肌原纖維蛋白的凝膠特性，且改善作用在添加量為0.5 mg/mL 時達到最大。