不同種質紫蘇葉揮發性成分化學型研究

陳家寶 郭龍 溫春秀 齊琳琳 溫賽群 鄭玉光 王蕾

中圖分類號 R282.6 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）08-0945-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.08.09

摘 要 目的：分析不同種質紫蘇葉揮發性成分的化學型，并探討其種質、葉片顏色與化學型的關系。方法：采用氣質聯用技術（GC-MS），以P4峰為參照，繪制30批紫蘇葉揮發性成分的指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）》進行相似度評價，確定共有峰。采用同一GC-MS法測定紫蘇葉揮發性成分;采用Qualitative Navigator（B.08.00）軟件分析并與NIST 17標準質譜數據庫進行檢索比對，分析各色譜峰對應的化合物;采用Origin 2018軟件進行聚類分析。結果：30批紫蘇葉揮發性成分共有13個共有峰，相似度為0.13～1.00。從30批不同種質紫蘇葉樣品中共鑒定出54種成分;聚類分析結果顯示，30批樣品可聚為三大類，其中SCY-1、YNT-9、YNX-17、YN-28為一類，以欖香素（PP-e）為主要揮發性成分，為PP-e型;GS-4、GS-7、GS-11、GS-19、HBA-14、HBA-20、GZZ-8、LN-39、GSL-27、GSQ-32、GSQ-33、GST-31、YNW-12、 LN-38為一類，除LN-38外均以紫蘇酮（PK）含量最高，為PK型[LN-38中芹菜腦（PP-a）含量高于紫蘇酮，為PP-a型];HBS-2、HBS-3、HBS-6、HBS-15、HBS-16、HBS-24、HBS-25、GX-26、SXS-30、SCC-36、RB-37、SC-29為一類，以紫蘇醛（PA）含量較高，為PA型;不同種質紫蘇葉顏色特征結果顯示，葉片顏色兩面綠的白蘇均為PK型，而葉片單面或兩面紫的紫蘇大多為PA型，耳齒紫蘇多為PP-e型。結論：紫蘇葉揮發性成分化學型與其葉片顏色之間存在一定的對應關系，葉片單面或兩面紫的紫蘇葉大多為PA型;葉片顏色為兩面綠的野生紫蘇、耳齒紫蘇 、白蘇均不屬于PA型，其中白蘇均為PK型;耳齒紫蘇多為PP-e型。

關鍵詞 紫蘇葉;氣質聯用技術;揮發性成分;化學型;指紋圖譜

Chemotype Study of Volatile Components from Perillae Folium of Different Germplasms

CHEN Jiabao1，GUO Long1，WEN Chunxiu2，QI Linlin2，WEN Saiqun2，ZHENG Yuguang1，3，WANG Lei1（1.College of Pharmacy/Traditional Chinese Medicine Processing Technology Innovation Center of Hebei Province， Hebei University of Chinese Medicine， Shijiazhuang 050200， China; 2. Institute of Cash Crops， Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Shijiazhuang 050051， China; 3. Hebei Chemical and Pharmaceutical College， Shijiazhuang 050026， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To analyze the chemotypes of volatile components from Perillae Folium of different germplasms， and to investigate the relationship of germplasm and leaf color with chemotype. METHODS： The fingerprints of volatile components from 30 batches of Perillae Folium were prepared by GC-MS with P4 peak as reference. Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprint （2004A edition） was applied to evaluate the similarity and confirm common peaks. The volatile components of Perillae Folium were determined by the same GC-MS method. Qualitative Navigator （B.08.00） software was used to analyze and compare with NIST 17.0 standard mass spectrum database. The compounds corresponding to the peak were analyzed; clustering analysis was carried out with Origin 2018 software. RESULTS： There were 13 common peaks in the fingerprints of volatile components from 30 batches of Perillae Folium. The similarities were 0.13-1.00. Totally 54 components were identified from 30 batches of Perillae Folium of different germplasm. Cluster analysis showed that 30 batches of Perillae Folium samples could be clustered into three categories; among them， SCY-1， YNT-9， YNX-17， YN-28 were clustered into one category， with phenylpropanoid-elemicin （PP-e as） the main volatile component， being PP-e type; GS-4， GS-7， GS-11， GS-19， HBA-14， HBA-20， GZZ-8， LN-39， GSL-27， GSQ-32， GSQ-33， GST-31， YNW-12， LN-38 were clustered into one category， and the content of perilla ketone （PK） in them was the highest except for LN-38， being PK type [the content of phenylpropanoid-apiol （PP-a） in LN-38 was higher than that of perilla ketone， being PP-a type]; HBS-2， HBS-3， HBS-6， HBS-15， HBS-16， HBS-24， HBS-25， GX-26， SXS-30， SCC- 36， RB-37， SC-29 were clustered into one category， and the content of perillaldehyde （PA） was the highest， being PA type. The color characteristics of Perillae Folium of different germplasm showed that Perilla frutescens （L.） Britt. var. frutescens with green leaves on both sides was PK type， while P. frutescens （L.） Britt. var. arguta with purple leaves on one or both sides was PA type， and P. frutescens （L.） Britt var. auriculato-dentata C. Y. Wu et Hsuan ex H. W. Li was PP-e type. CONCLUSIONS： The chemotype of volatile components in Perillae Folium have a certain corresponding relationship with their leaf colors. Most of P. frutescens （L.） Britt. var. arguta with purple leaves on one side or both sides are PA type. P. frutescens （L.） Britt. var. acuta （Thunb.） Kudo，? P. frutescens （L.） Britt var. auriculato-dentata C. Y. Wu et Hsuan ex H. W. Li and P. frutescens （L.） Britt. var. frutescens with green leaves on both sides? do not belong to PA type， among which P. frutescens （L.） Britt var. frutescens is PK type， while P. frutescens （L.） Britt var. auriculato-dentata C. Y. Wu et Hsuan ex H. W. Li is mostly PP-e type.

KEYWORDS? ?Perillae Folium; GC-MS; Volatile components; Chemotypes; Fingerprint

紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.為唇形科紫蘇屬一年生直立草本植物，在我國分布廣泛，河北、甘肅、遼寧、山西、陜西、山東、江蘇、湖南、湖北、云南、四川、廣西、廣東等?。▍^）均有廣泛種植，可供藥用和食用[1]。紫蘇始載于《名醫別錄》，列為中品，分“蘇”和“荏”記載[2]。紫蘇葉為紫蘇的干燥葉（或帶嫩枝），其辛、溫，歸肺、脾經，具有解表散寒、行氣和胃之功效，常用于治療風寒感冒、咳嗽嘔惡、妊娠嘔吐、魚蝦中毒等癥[3]?，F代藥理研究發現，紫蘇葉具有降血壓、鎮靜、調節糖脂代謝、抗抑郁、抗氧化和抗腫瘤等藥理活性[4-10]。

《中國植物志（第66卷）》記載的紫蘇屬植物只包括紫蘇（原變種）P. frutescens（L.）Britt. var. frutescens這1個種及回回蘇P. frutescens（L.）Britt. var. crispa（Thunb.）Hand.-Mazz.、野生紫蘇P. frutescens（L.）Britt. var. acuta（Thunb.）Kudo和耳齒紫蘇P. frutescens（L.）Britt. var. auriculato-dentata C. Y. Wu et Hsuan ex H. W. Li等3個變種[1]。但歷代本草常將葉片顏色為兩面綠者稱為“白蘇”，單面或者雙面紫者稱為紫蘇[11]?！侗静萁浖ⅰ吩?，“葉下紫色，而氣甚香，其無紫色不香似荏者，名野蘇，不堪用”[12]?？梢?，當時所稱的“荏”就是現代所稱的“白蘇”[11]。歷代本草將二者分開，并明確指出“白蘇”不能代替“紫蘇”入藥，可見古人用藥時就將葉片顏色及氣味不盡相同的“紫蘇”和“白蘇”分開使用。2020年版《中國藥典》（一部）對紫蘇葉的性狀描述也為“兩面紫色或者上表面綠色，下表面紫色”[3]。紫蘇外觀形態差異較大，目前對紫蘇屬植物種系及變種的分類存在一定爭議，國內有學者建議將“紫蘇”定名為P. frutescens（L.）Britt. var. arguta，“白蘇”定名為P. frutescens（L.）Britt.var. frutescens[13-14]?，F代分類學家Merrill認為，葉片顏色這一性狀的變異是由栽培引起的，《中國植物志（第66卷）》中也將“紫蘇”和“白蘇”歸并為一種[1]。

揮發油是紫蘇發揮藥效的重要成分，具有抑菌、抗抑郁、抗炎、抗氧化、解熱等藥理活性[15-19]。2020年版《中國藥典》（一部）規定，紫蘇葉總揮發油含量不得少于0.40%（mL/g）[2]。日本學者研究了紫蘇葉揮發性成分的構成，并根據紫蘇葉所含揮發性成分的主要類型和含量差異，將其分為紫蘇醛型（PA）、紫蘇酮型（PK）、檸檬醛型（C）、芳香族化合物（PP）、胡椒烯酮型（PT）、香薷酮型（EK）等6種化學型[20-21]。我國學者也對國內紫蘇種質資源的揮發性成分化學型進行了研究，結果表明，紫蘇化學型與表型存在一定的相關性，從紫蘇植物的外部形態可以初步判斷其化學型及其主要化學成分，但這種相關性并不是絕對的[22-24]。

氣質聯用技術（GC-MS）始于20世紀50年代后期，其兼具氣相色譜的高分辨率和質譜的高靈敏度，特別適用于復雜揮發性組分的分離、分析，現已被廣泛用于食品、醫藥、化工等領域的研究[25-27]。為探討紫蘇葉片顏色、種質劃分與其揮發性成分化學型的關系，本研究對30批不同品種的紫蘇葉片顏色特征進行考察;采用GC-MS 法分析紫蘇葉揮發性成分構成，比較不同品種紫蘇葉揮發性成分指紋圖譜的差異;采用聚類分析并結合紫蘇葉揮發性成分特征確定不同品種紫蘇葉的化學型;同時，結合紫蘇葉片顏色信息，探討紫蘇葉片顏色與化學型之間的關系，旨在為紫蘇植物學分類及紫蘇不同種質資源應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent 7890B/5977B型GC-MS儀（美國Agilent公司）、FW100型高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）、BSA224S-CW型萬分之一電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）、JP-060S型潔盟牌超聲波清洗機（深圳市潔盟清洗設備有限公司）、 Eppendorf 5418型高速臺式離心機（艾本德中國有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

正己烷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號M0102-21230，純度≥98%，色譜純）。

30批紫蘇子于2019年5月播種于河北省農林科學院中草藥種植園，于2019年8月31日采收新鮮葉片，陰干后作為紫蘇葉樣品。各樣品經河北中醫學院藥學院鄭玉光教授鑒定為紫蘇及其變種的干燥葉（鑒定結果見表1），標本存放于河北中醫學院中藥炮制技術創新中心。30批紫蘇葉樣品信息來源見表1。

2 方法與結果

2.1 紫蘇葉揮發性成分GC-MS指紋圖譜的建立

2.1.1 紫蘇葉揮發性成分的提取 取干燥的紫蘇葉樣品凈選后粉碎，過60目篩。稱取樣品粉末0.10 g，置于1.5 mL離心管中，加入正己烷1 mL，充分振搖，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）提取15 min，以13 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.1.2 試驗條件 氣相色譜條件——以HP-5石英毛細管柱（0.32 mm×30.0 m，0.25 μm）為色譜柱，載氣為高純氦氣，進樣口溫度為250 ℃，程序升溫（初始溫度從45 ℃開始，以10 ℃/min升溫到100 ℃;再以4 ℃/min升到280 ℃，保持10 min），進樣量為1 μL，分流比為2 ∶ 1。質譜條件——以電子轟擊離子源為離子源，離子能量為70 eV，接口溫度為250 ℃，掃描質量范圍為50～500 amu，溶劑延遲時間為3 min。

2.1.3 精密度試驗 取“2.1.1”項下提取的紫蘇葉揮發性成分（編號HBS-2）適量，按“2.1.2”項下試驗條件連續進樣6次，記錄色譜圖。以P4峰（因P4峰相對含量較高且穩定）為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，13個共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.21%（n=6），相對峰面積的RSD為0.21%～2.58%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.4 穩定性試驗 取“2.1.1”項下提取的紫蘇葉揮發性成分（編號HBS-2）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.2”項下試驗條件進樣分析。以P4峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，13個共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.16%（n=6），相對峰面積的RSD為0.27%～2.70%（n=6），表明上述樣品于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.5 重復性試驗 取紫蘇葉樣品（編號HBS-2）粉末，共6份，每份0.10 g，按 “2.1.1”項下方法提取紫蘇葉揮發性成分，再按 “2.1.2”項下試驗條件進樣分析。以P4峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，13個共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.61%（n=6），相對峰面積的RSD為0.20%～2.94%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.6 指紋圖譜的建立 按“2.1.1”項下方法提取30批紫蘇葉樣品的揮發性成分，再按 “2.1.2”項下試驗條件進樣分析。將所得30批樣品的GC-MS圖譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）》，以HBS-2批樣品為參照圖譜，設置時間窗口為0.1 min，經共有峰多點自動校正，生成30批紫蘇葉揮發性成分的疊加指紋圖譜（圖1），采用中位數矢量法生成對照指紋圖譜（R）。結果，30批紫蘇葉揮發性成分的疊加指紋圖譜中共有13個共有峰（P1～P13）。

2.1.7 相似度評價 將30批紫蘇葉樣品揮發性成分的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）》，進行相似度評價。結果，各批樣品的相似度為0.13～1.00，表明30批紫蘇葉揮發性成分的相對含量存在明顯差異，詳見表2。

有研究認為，各樣品間相似度越接近1，其揮發性成分的組成和相對含量相似度越高[28-30]，故本研究以相似度大于0.75為標準進行分組。結果，SCY-1、YNT-9、YNX-17、YN-28為第一組;HBS-2、HBS-3、HBS-6、HBS-15、HBS-16、HBS-24、HBS-25、GX-26、SC-29、SXS-30、SCC-36、RB-37為第二組;GS-4、GS-7、GZZ-8、GS-11、YNW-12、HBA-14、GS-19、HBA-20、GST-31、GSQ-32、GSQ-33為第三組;GSL-27及LN-39相似度較低，但二者均與第三組樣品的相似度較高，可歸為第三組，而LN-38與其他樣品相似度在0.21～1.00之間，與樣品GS-7、HBS-16、GS-19、HBA-20相似度大于0.6，提示LN-38為介于第二組和第三組之間的一個類型。

2.2 紫蘇葉揮發性成分的鑒定

將30批紫蘇葉樣品適量混合后，按“2.1.1”項下方法提取紫蘇葉揮發性成分，再按“2.1.2”項下試驗條件進樣分析，得到紫蘇葉揮發性成分GC-MS總離子流圖（圖2）;采用Qualitative Navigator（B.08.00）軟件對紫蘇葉不同揮發性成分的總離子流圖進行匹配。結果，共得到54個特征峰，約占總峰面積的90%。通過將各峰質譜圖與NIST 17.0標準質譜數據庫進行檢索比對，鑒別得到54個特征峰所對應的揮發性成分，結果見表3。

2.3 紫蘇葉揮發性成分化學型分析

采用Qualitative Workflows（B.08.00）軟件及Quant Analysis（B.09.00）定量分析軟件提取30批紫蘇葉樣品中54個揮發性成分的峰面積進行相對定量分析（將峰面積進行歸一化及對數轉化后，計算相對含量）;采用Origin 2018軟件以組間平均數連接法、Euclidean距離為度量標準進行聚類分析。結果，54個揮發性成分中相對含量較高的化合物為D-檸檬烯、紫蘇酮、紫蘇醛、石竹烯、欖香素、棕櫚酸、角鯊烯等，且不同紫蘇葉樣品中揮發性成分的相對含量存在明顯差異，詳見圖3。由圖3可見，30批紫蘇樣品根據所含主要揮發性成分種類及含量的不同可分為三大類：SCY-1、YNT-9、YNX-17、YN-28為一類，以欖香素（PP-e）為主要揮發性成分，為 PP-e型;GS-4、GS-7、GS-11、GS-19、HBA-14、HBA-20、GZZ-8、LN-39、GSL-27、GSQ-32、GSQ-33、GST-31、YNW-12、LN-38為一類，除LN-38外均以紫蘇酮含量最高，為PK型[LN-38雖然紫蘇酮含量也較高，但其芹菜腦含量最高，因此其為芹菜腦型（PP-a型）];HBS-2、HBS-3、HBS-6、HBS-15、HBS-16、HBS-24、HBS-25、GX-26、SXS-30、SCC-36、RB-37、SC-29為一類，以紫蘇醛含量較高，為PA型。該結果與相似度分析結果較為一致（圖中，菱形、三角形、矩形、圓形以及五角星分別表示野生紫蘇、耳齒紫蘇、白蘇、紫蘇和回回蘇。綠色及紫色表示葉片顏色為綠色或紫色）。

2.4 紫蘇種質、葉片顏色與化學型的關系分析

4批耳齒紫蘇樣品（YNT-9、YNW-12、YNX-17、YN-28）兩面葉片顏色均為綠色，其中3批（YNT-9、YNX-17、YN-28）為PP-e型，1批（YNW-12）為PK型。2批野生紫蘇葉樣品（SCY-1、SCC-36）中，葉片顏色為兩面綠色的（SCY-1）為PP-e型，而葉片顏色為正面綠背面紫（SCC-36）的為PA型。1批回回蘇樣品（GX-26）為PA型。13批紫蘇樣品中2批（GZZ-8、GSQ-32）為PK型，1批（LN-38）為PP-a型，10批紫蘇（HBS-2、HBS-3、HBS-6、HBS-15、HBS-16、HBS-24、HBS-25、SC-29、SXS-30、RB-37）為PA型。10批白蘇樣品（GS-4、GS-7、GS-11、HBA-14、GS-19、HBA-20、GSL-27、GST-31、GSQ-33、LN-39）葉片顏色為兩面綠的均為PK型。

3 討論

本研究前期考察了不同溶劑（甲醇、正己烷）、不同料液比（1 ∶ 5、1 ∶ 10、1 ∶ 15，g/mL）、不同提取時間（10、15、20 min）對揮發性成分提取率的影響。結果，當溶劑為正己烷、料液比為1 ∶ 10、提取時間為15 min時，紫蘇葉揮發性成分可提取完全。

紫蘇作為一種藥食同源的植物，應用范圍極為廣泛，其莖、葉、果實均可入藥，具有較大的藥用價值及經濟價值[31-32]。市售紫蘇大多為栽培品，在種植過程中，不同種質紫蘇間的自然雜交以及人工定向培育均可導致紫蘇種質類型的復雜多樣和表型多變。一方面，有學者認為，紫蘇外觀形態改變是由栽培環境變化引起的，不足以作為其種下分類的依據[1];另一方面，從本草古籍到2020年版《中國藥典》對于藥用紫蘇的外觀形態特別是葉片顏色均有相關規定[3，12]。因此，對于紫蘇外觀形態是否可以作為其種質分類依據存在爭議。

本研究中，30批紫蘇葉樣品的相似度為0.13～1.00，表明30批紫蘇葉樣品中有揮發性成分構成相似，也有存在明顯差異的成分。從30批紫蘇葉樣品中共鑒別出54個揮發性成分，主要屬于PA、PK和PP-e型，有1批紫蘇樣品為PP-a型。有10批葉片顏色為兩面綠的“白蘇”樣品均屬PK型，與大部分葉紫或者單面紫的紫蘇揮發性成分差異較大。據相關文獻報道，雖然PK型主要成分紫蘇酮具有一定的促進腸道推進作用，但也有心臟毒性和肺毒性，若攝入紫蘇酮劑量過大，會引起急性心力衰竭和肺水腫等[33-36]。鑒于目前PK型紫蘇中紫蘇酮對人的中毒劑量尚不明確，因此應盡量避免大量食用PK型紫蘇。

具有較高含量紫蘇醛的PA型紫蘇香味更加濃郁，出口的栽培紫蘇均為PA型[37]。本研究發現，所有葉片顏色為兩面綠的紫蘇品種，不論是野生紫蘇、耳齒紫蘇還是白蘇，都不屬于PA型。所有PA型紫蘇樣品的葉片顏色均為紫色或單面紫色，但葉片紫色或單面紫色的紫蘇并不一定屬于PA型，如GSQ-32、GZZ-8雖然葉片顏色分別為紫色和單面紫色，但屬于PK型。其他學者在研究紫蘇葉片顏色與其化學型的關系中發現，雖然紫蘇葉片顏色及其化學型存在一定的關系，但并不是絕對的：如魏長玲等[37]在對全國43個野生以及栽培紫蘇種質進行研究的過程中發現，“白蘇”雖然大部分屬于PK型，但也有2份“白蘇”樣品為PA型。這提示單純從葉片顏色來判斷其化學型及是否可以入藥不夠全面，不能將葉片顏色作為判斷其是否符合藥用標準的唯一指標。目前，2020年版《中國藥典》（一部）對紫蘇葉總揮發油含量有一定的要求[3]，隨著對紫蘇葉揮發性成分藥理活性及毒性研究的不斷深入，有必要對紫蘇葉特征性發揮性成分制定更具體的要求。

綜上所述，紫蘇葉揮發性成分化學型與其葉片顏色之間存在一定的對應關系，葉片單面或兩面紫的紫蘇大多為PA型;葉片顏色為兩面綠的野生紫蘇、耳齒紫蘇 、白蘇均不屬于PA型，其中白蘇均為PK型，耳齒紫蘇多為PP-e型。

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（收稿日期：2020-12-20 修回日期：2021-03-03）

（編輯：陳 宏）