NO促進糖酵解增強急性中耳炎的炎癥應答和細菌清除

艾容霜范芳梅,2馬毓蓉,3董益麟,4何纖,5張欣欣,6朱憶婷李丁一何於娟*

1重慶醫科大學檢驗醫學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室(重慶 400016）

2貴陽市婦幼保健院檢驗科（貴陽 550000）

3昆明醫科大學附屬第二醫院檢驗科（昆明 650000）

4重慶醫科大學附屬大學城醫院檢驗科（重慶 400016）

5龍泉驛區第一人民醫院檢驗科（成都 610000）

6山東大學齊魯醫院檢驗科（青島）(青島 266000）

中耳炎發病機制復雜多樣，細菌感染是其發病原因之一[1]。而急性中耳炎是兒童最常見的感染性疾病之一[2]，肺炎鏈球菌是其最常見的致病菌之一[3]。若急性中耳炎（AOM）久治不愈或反復發作，則造成中耳組織不可逆損傷，引起患兒聽力下降、后天性耳聾、語言發育障礙，嚴重影響患兒生活質量[4]。因此，深入了解AOM的致病機制，將更加有效地預防和治療AOM。

近年來，越來越多的研究發現活化的免疫細胞，如巨噬細胞，樹突狀細胞等，在抵抗病原體入侵時發生了“代謝重編程”以供自身能量需要。本課題組前期研究證實[5]，在S.pnAOM中，中性粒細胞作為天然免疫的第一道防線，是控制肺炎鏈球菌感染的關鍵效應細胞（≥98%）。然而，在AOM時，募集到中耳腔的中性粒細胞是否發生代謝變化尚無文獻報道。有研究發現，脂多糖/γ-干擾素（LPS/IFN-γ）等刺激巨噬細胞和樹突細胞（DCs）激活后，糖酵解的轉變伴隨有iNOS介導NO的產生，它以自分泌或旁分泌的方式使電子傳遞鏈復合物亞硝基化，從而抑制線粒體電子傳遞鏈，增強糖酵解代謝[6]。并且，有文獻報道分泌性中耳炎患者中耳積液中NO表達增高[7]。然而，在AOM中，NO是否可以通過參與調節糖酵解來影響中耳的炎癥應答和細菌清除尚不清楚。

因此，本研究利用糖酵解抑制劑2-脫氧葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2DG）及誘導型一氧化氮合酶（iNOS）抑制劑1400W分別處理后，觀察糖酵解代謝變化、免疫應答及對細菌清除的影響，初步探討糖酵解和NO在急性中耳炎中的作用機制，為急性中耳炎的治療和慢性中耳炎的預防奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 動物模型

本實驗采用C57BL/6小鼠，6～8周齡，隨機分為4組：磷酸鹽緩沖液PBS對照組、S.pn感染組、S.pn+2DG處理組和S.pn+1400W處理組，每組小鼠5～6只，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，聽泡穿刺法將S.pn 19F（106 CFU/耳）接種于小鼠耳內建立中耳炎模型。將2DG溶于菌懸液后以相同方法接種于耳內（2DG終濃度為32.8mg/ml）。小鼠購自重慶醫科大學動物實驗中心。小鼠的使用得到重慶醫科大學動物中心的許可。

1.2 中耳灌洗液上清液的葡萄糖含量測定

采用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量，葡萄糖試劑盒購于普利萊公司，按說明書操作。

1.3 中耳灌洗液上清液的乳酸含量測定

乳酸檢測試劑盒購于Sigma公司；按說明書操作。

1.4 細胞因子測定

通過商業化的酶聯免疫反應試劑盒測定MELF上清中IL-1β(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA,#MLB00C),TNF-α (R&D Systems,Min‐neapolis,MN,USA,#MTA00B)和 IL-6(R&D Sys‐tems)濃度。

1.5 熒光定量PCR

采用RNeasyMinikit(Qiagen,Valencia,CA)，按說明書提取中耳灌洗液細胞中總RNA?？俁NA提取后進行逆轉錄及熒光定量PCR，逆轉錄試劑盒為TAKARA逆轉錄試劑盒。

1.6 免疫熒光

收集至少3只小鼠中耳灌洗液MELF，取100μl甩片，500 rpm離心5分鐘。干燥5分鐘后用4%多聚甲醛固定10分鐘。5%正常驢血清37℃封閉1小時，兔抗肺炎鏈球菌多糖多克隆抗體4℃孵育過夜(1:1000;Staten Serum Institute,Denmark)。二抗為結合有DyLight 488的驢抗兔IgG(1:1000;Jackson Immuno-Research Laboratories,West Grove,PA)，37℃孵育1小時。PBS洗滌后DAPI(1:800;Invit‐rogen,USA)復染。尼康ECLIPSE 80i采集免疫熒光圖像。

1.7 統計學方法

所有實驗數據采用GraphPad Prism version 5.0(GraphPad Software,USA)統計軟件行兩個獨立樣本的t檢驗，所有實驗數據用±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 S.pn AOM中，糖酵解上調

本研究采用聽泡穿刺接種成功建立了肺炎鏈球菌19F AOM小鼠模型。實時定量PCR技術檢測中耳灌洗液細胞中糖酵解相關基因的表達，結果顯示，在建模后第1天，己糖激酶3（Hk3）、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（Pfkfb3）mRNA表達水平上調（P＜0.001），在建模后第3天，丙酮酸激酶2（Pkm2）mRNA表達水平也明顯增加（P＜0.01），除此之外，乳酸脫氫酶A（Ldha）和乳酸轉運體Mct4mRNA水平也呈現上調趨勢（圖1A）。進一步對MELF中葡萄糖消耗量和乳酸的生成量進行檢測，結果表明在建模后第1天，S.pn感染組MELF中葡萄糖的含量明顯低于PBS對照組（圖1B，P＜0.01），而乳酸生成量明顯高于PBS對照組（圖1C，P＜0.05），表明在AOM中，葡萄糖消耗和乳酸產生均增強。上述結果表明AOM時中耳腔募集的中性粒細胞糖酵解相關基因的表達上調，糖酵解增強。

圖1 S.pnAOM中，糖酵解上調。A:qPCR檢測S.pnAOM MELF中中性粒細胞糖酵解相關基因表達；B/C:MELF上清液中葡萄糖和乳酸水平；*P＜ 0.05，**P＜ 0.01，***P＜ 0.001 ；MELF，中耳灌洗液。Fig.1 Glycolysis was up-regulated in S.pn AOM.A.Ex‐pression of glycolysis related genes in neutrophils of MELF was measured by qPCR.B/C.The levels of glucose and LDH in MELF supernatant.*P＜ 0.05,**P＜ 0.01,***P＜ 0.001;MELF,middle ear lavage fluid.

2.2 S.pn AOM中，iNOS表達上調

為驗證S.pn感染后，中耳腔的中性粒細胞糖酵解增強是否通過增加iNOS表達，釋放NO來實現，本研究對中耳灌洗液細胞iNOS mRNA水平進行了檢測。結果顯示，在中耳炎模型建立后第1、3天，中耳灌洗液細胞中iNOS表達水平均明顯上調（圖2A，P＜0.001），與上述結果一致的是，MELF中NO的量也明顯上調（圖2B，P＜0.05）。而iNOS抑制劑1400W處理后明顯降低了中耳灌洗液中NO水平（圖2B）。

圖2 S.pn AOM中，iNOS表達上調。A:qPCR檢測MELF細胞的中iNOS表達水平；B:MELF中NO水平；*P＜0.05，***P＜0.001。Fig.2 The expression of inos was up-regulated in S.pnAOM.A.Expression of ions in cells of MELF was measured by qPCR.B.NO level in MELF supernatant.*P＜0.05,***P＜0.001.

2.3 S.pn AOM中，糖酵解促進細菌清除和炎癥反應

在急性中耳炎小鼠模型建立后第1、3天，MELF細菌培養計數顯示，與S.pn處理組相比，S.pn+2DG處理組中耳腔細菌載量更高（圖3A，P＜0.01）。中耳灌洗液細胞免疫熒光結果也與此一致，即S.pn單獨處理組中耳細菌載量較2DG處理組減少（圖3B）。上述結果表明，AOM時，糖酵解可以促進中耳腔細菌清除。而2DG抑制糖酵解后，MELF中炎癥細胞數量明顯減少（圖3C，d1，P＜0.05），表明S.pn感染時，糖酵解可以增強炎癥細胞滲出。此外，本研究采用ELISA方法檢測了小鼠MELF中三種炎癥因子的水平，結果顯示，在急性中耳炎小鼠模型中，IL-1β，TNF-α和IL-6在MELF中的含量明顯增加，而經糖酵解抑制劑2DG處理后，MELF中IL-1β，TNF-α水平則明顯降低，但對IL-6無明顯影響（圖3D，P＜0.01）。上述結果表明糖酵解在S.pn誘導的AOM中發揮著促進炎癥反應和細菌清除的作用。

圖3 S.pn AOM中，糖酵解促進細菌清除和炎癥反應。A:MELF細菌載量；B:MELF細胞免疫熒光圖像；C:MELF炎癥細胞計數；D:ELISA檢測MELF炎癥因子；*P＜ 0.05，**P＜0.01。Fig.3 Glycolysis promoted bacteri‐al clearance and inflammatory re‐sponse in S.pnAOM.A.Bacterial load in MELF.B.Cell immunofluo‐rescence image in MELF.C.Inflam‐matory cell count in MELF.D.In‐flammatory factors in MELF super‐natant were measured by ELISA.*P＜ 0.05，**P＜ 0.01.

2.4 S.pn AOM中，NO通過調節糖酵解促進細菌清除和炎癥反應

接下來，本研究使用iNOS抑制劑1400W進一步探索NO在S.pn AOM中的作用。有趣的是，1400W同2DG處理組相似，表現為中耳細菌載量增加、炎癥細胞滲出減少及組織損傷減輕。對中耳灌洗液細菌計數發現，1400W處理組細菌載量較S.pn單獨處理組明顯增加（圖4A；d1，P＜0.05；d3，P＜0.01）。在S.pn AOM的第1天和第3天，1400W處理組中耳灌洗液中炎癥細胞滲出明顯減少（圖4B，P＜0.05），炎癥因子TNF-a的表達水平降低（P＜0.05），與HE染色結果相符，提示NO發揮了促進炎癥反應和細菌清除的作用（圖4C、D）。

圖4 S.pn AOM中，NO通過調節糖酵解促進細菌清除和炎癥反應。A:MELF中細菌載量；B:MELF中炎癥細胞計數；C:ELISA檢測MELF上清液炎癥因子；D:中耳組織病理學改變（HE染色）；*P＜0.05,**P＜0.01。Fig.4 NO promoted inflammatory response and bacterial clearance by regulating glycolysis in AOM mouse model.A.Bacteria loads in MELF.B.Inflammatory cell count in MELF.C.Inflammatory factors in MELF supernatant were measured by ELISA.D.Histopathological changes in the middle ear(HE staining).*P＜0.05,**P＜0.01.

考慮到有研究報道免疫細胞中iNOS表達介導NO的產生可增強糖酵解代謝，因此我們接下來探究在S.pn AOM中，NO是否可以通過影響糖酵解，而非傳統的直接殺傷功能發揮作用。如圖所示，與對照組相比，1400W處理組中耳灌洗液中NO的表達明顯受抑（圖5A，P=0.0511）；與此同時，中耳灌洗細胞中Hk3、Mct4的表達明顯下調（圖5B，P＜0.05）。同時，我們發現1400W處理組葡萄糖的消耗和乳酸的產生明顯降低（圖5C、D；P＜0.05）。然而，與對照組相比，2DG處理組中耳灌洗液中NO的表達無顯著性差異，提示NO可以通過參與調控糖酵解，進而促進細菌清除和炎癥反應。

圖5 S.pnAOM中，NO通過調節糖酵解促進細菌清除和炎癥反應。A:MELF中NO含量；B:qPCR檢測MELF炎癥細胞中糖酵解相關基因mRNA的表達情況；C/D:MELF上清液中葡萄糖含量以及乳酸水平；*P＜0.05,**P＜0.01。Fig.5 NO promoted inflammatory response and bacterial clearance by regulating glycolysis in AOM mouse model.A.NO con‐tent in MELF after 1400W treatment.B.Expression of glycolysis related genes in cells of MELF was measured by qPCR after 1400W(4mM)treatment.C/D.The levels of glucose and LDH in MELF supernatant.*P＜0.05,**P＜0.01.

3 討論

機體的免疫細胞在多數情況下處于相對靜息狀態，但在遭受感染等刺激時，免疫細胞迅速活化，誘導大量基因表達和生物活性物質釋放。細胞從相對靜止狀態到活化及發揮功能的過程中，需要大量能量供應[8]。近年來，研究發現機體發生感染時活化的免疫細胞（如巨噬細胞，樹突狀細胞，Th17細胞等）發生了從氧化磷酸化向糖酵解轉變的“代謝重編程”以提供能量和中間產物[9]，例如，鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌或結核分枝桿菌等微生物可以強烈誘導小鼠巨噬細胞的糖酵解代謝[10,11]。值得注意的是，上述研究大多關注于巨噬細胞的代謝變化且局限于體外實驗。且早在幾十年前，就有研究證明中性粒細胞胞質內線粒體數量較少，主要是通過糖酵解來產生自身所需能量[12]。我們在AOM小鼠模型中觀察到S.pn感染時，募集至中耳腔的中性粒細胞糖酵解關鍵酶Hk3、Pfkfb3、丙酮酸激酶2（Pkm2）和葡萄糖轉運體Glut1及乳酸轉運體Mct4明顯上調；葡萄糖消耗和乳酸生成也明顯增加，表明募集到中耳腔的中性粒細胞糖酵解代謝增強。

糖酵解不僅對細胞遷移滲出起著調控作用，對細胞免疫功能調控也發揮著重要作用。免疫細胞中糖酵解關鍵基因和蛋白酶的上調以及中間代謝產物的累積可以影響免疫細胞的功能，包括影響免疫細胞對病原體的吞噬殺傷能力、抗菌物質及炎癥因子的釋放能力。本研究中，我們采用2DG抑制糖酵解后，中耳腔細菌載量明顯增加，炎癥細胞浸潤明顯減少，細胞因子分泌減少，表明糖酵解可能通過增強中耳炎癥反應來促進中耳腔S.pn清除，與文獻報道一致。

一氧化氮（NO）是一種氣體自由基，以L-精氨酸和氧為底物，由誘導型一氧化氮合酶（iNOS）催化合成。中性粒細胞、巨噬細胞、和內皮細胞等多種細胞均能生成NO。一方面，NO具有直接殺菌活性[13]；另一方面，NO可以介導炎癥細胞凋亡及促炎因子產生[14,15]。此外，有文獻報道，炎性刺激誘導免疫細胞發生糖酵解代謝，還可以通過上調iNOS，增加NO產生，導致電子傳遞鏈復合物亞硝基化，從而抑制線粒體呼吸，增強糖酵解代謝[6]。本研究中，我們也發現，S.pn感染后，小鼠中耳灌洗液中性粒細胞，中耳上皮細胞中iNOS水平顯著上調，中耳灌洗液中NO水平也明顯增高。iNOS抑制劑1400W處理小鼠后，與2DG處理組相似，糖酵解相關基因表達下調，中耳灌洗液中葡萄糖消耗及乳酸生成減少，表明NO的確參與了糖酵解代謝。同時，也發現iNOS抑制劑1400W處理小鼠后，中耳細菌載量增加、炎癥細胞滲出減少，但組織損傷減輕表明NO可以促進糖酵解代謝進而促進細菌清除和炎癥反應。

總之，本研究表明，在S.pn AOM中，NO不僅具有直接殺菌作用，也可以通過調節糖酵解促進細菌清除和炎癥反應，但同時也會加重組織損傷。因此，本研究的結果提示，NO作為一種氣體自由基，對AOM的發生發展具有“雙刃劍”作用，控制NO的活性可能影響AOM的預后，具有潛在的應用前景。