獲取地小耳畸形優先可疑基因途徑的綜述

許夢 吳軍成

山東第一醫科大學附屬醫院（濟南 250000）

泰安市中心醫院（泰安 271000）

先天性小耳畸形是由于胚胎時期第一、二腮弓及第一腮溝的發育異常引起的外、中耳畸形[1]，由遺傳、環境、社會等多種因素共同影響，病理發育機制復雜[2]。先天性小耳畸形分為單純性和綜合征型小耳畸形，可以同時伴發多個器官的發育異常[1,3]?；颊叩亩炕紊婕巴舛笮?、形態異?；蚪Y構畸形甚至缺失，嚴重者表現為無耳畸形伴外耳道閉鎖[4]。由于不同患者耳部畸形異質性較高，使得超聲等常規產前檢查容易出現漏診等。調查顯示，不同種族、不同地域先天性小耳畸形的發病率不同，為0.83-17.4/10000不等[5]。盡管目前有大量研究探索其致畸病因，但該病的具體致病機制尚未明確，因此探求先天性小耳畸形的病因十分重要，可以為遺傳咨詢、分子水平的基因診斷提供更加可靠依據。國際上眾多專家學者致力于尋找小耳畸形的易感基因，但由于基因作用機制復雜，僅在綜合征型小耳畸形致病基因診斷中取得了一定成績，散發性單純小耳畸形的遺傳學研究進展甚微[6]?；蛟\斷技術的飛速發展使人類可以應用多種方法探索先天性小耳畸形的致病基因。在本文中將針對現今四種主要的基因鑒定方法，在闡述其優勢及局限性的同時，首次將基因檢測進展以“優先可疑基因庫”的形式進行總結探討，“優先可疑基因庫”是指在進行分子水平的基因診斷時需要優先考慮和進行篩查的基因組，它應該包括：已明確的綜合征型小耳畸形的致病基因；在人、豬、羊和鼠等小耳畸形模型中，通過全基因組關聯分析已獲取的與顱面部發育有關的基因；與之相關的拷貝數變異；小鼠基因組信息數據庫中與之相關的致病基因等。以期研究者們在進行小耳畸形遺傳學研究時，可以利用該小耳畸形致病基因鑒定的系統性方法，并優先從“優先可疑基因庫”中篩查致病基因，形成小耳畸形基因診斷的系統性方法和基因庫。

1 綜合征型小耳畸形調研

先天性小耳畸形可以單獨出現[7]，但約40%的患者伴發其他器官、結構的先天畸形或發育異常[8]，如頜面部、心血管、泌尿系統等，其中部分以綜合征的形式存在，且已明確了致病基因。比如TCOF1的突變可以引起Treacher Collins綜合征[9]，SIX1和EYA1的突變導致鰓耳綜合征的發生[10]。

綜合征型小耳畸形致病基因的探索及其伴發畸形的相關研究極大的促進了小耳畸形遺傳學的發展[11]。HMX1的突變可以導致眼耳綜合征的發生。而Cox等人通過進一步實驗發現HMX1基因下游的保守非編碼元件（conserved noncoding ele‐ment,CNE）突變可以組織特異性地增強HMX1的表達。該發現證明保守區域的突變可能通過對特定基因的調節作用引起單純性小耳畸形[5]。Gold‐enhar綜合征又稱為oculo-auricular-vertebral spectrum（OAVS）或hemifacial microsomia（HFM），Kelberman等對兩個患病家系進行了全基因組掃描、連鎖分析，認為最為可能的候選基因為GSC（goosecoid，OMIM：138890）。然而在另外兩個家系和120個散發病例中均沒有發現GSC基因突變[12]。虞佩等人對43例先天性小耳畸形患者的GSC基因進行了測序，其中2例患者在該基因的外顯子3的125bp處發生了錯義突變。Luquetti等學者發現了10種有意義的小耳畸形優先伴發畸形，如唇腭裂、后鼻孔閉鎖和軸前多指等。其中后鼻孔閉鎖和軸前多指在OAVS中并不常見，表明兩者與小耳畸形之間可能存在較為隱匿的遺傳發育聯系，并推測這些特定的優先伴發組合可能是SALL1、FGF10/FGF2-3參與的基因路徑下游的缺陷或與該路徑相交叉的缺陷造成的。在最近研究中，Shankar等學者通過對OAVS患者血樣分析發現，先證者AMI‐GO2(c.901C＞T)基因產生無義替換，而在ZCCHC14(c.1198C＞T)和 SZT2(c.2951C＞T)上產生錯義替換，AMIGO2基因的無義替換引入了一個過早終止密碼子，可能通過無義介導的通路衰變使該基因失去功能，因此相較于ZCCHC14和SZT2的錯義替換而言，AMIGO2基因被認為是一個更強的候選基因[12]。

由于小耳畸形的伴發畸形多樣，綜合征表型異質性高、數量龐大、最低診斷標準尚存爭議。當患者首次就診時，醫師應考慮到綜合征型小耳畸形的可能性，對其進行詳盡的全身檢查評估，發現隱匿的合并畸形，確定器官異常的特征性組合模式，從而做出準確診斷。小耳畸形及其伴發畸形的診斷準確性十分關鍵，一旦對表型發生漏判、誤判，將會影響接下來對基因突變檢測結果的解讀。已經發現的綜合征型小耳畸形的致病基因是目前已知的在耳部甚至是顱面部發育中起著重要作用的基因，因此可以最先從這些致病基因入手對單純性患者進行篩查。另外鑒于小耳畸形伴發畸形可能存在共同起源或致病機制，因此臨床上需要詳細記錄伴發畸形及其發生模式，或許可以為小耳畸形病因研究提供線索。

通過 Pubmed，Science Direct和 Web of Science等途徑，檢索收集已報道的與小耳畸形相關的主要綜合征及其致病基因，見表1。

表1 主要的綜合征型小耳畸形及其已知致病基因。Table 1 Major human disorders and syndromes with microtia

2 全基因組關聯分析

早期針對小耳畸形的候選基因研究存在樣本量少、可重復性差等缺點，且小耳畸形致病機制復雜，單基因病連鎖分析等方法難以奏效。全基因組關聯分析（genome-wide association study,GWAS）指在全基因組層面上，開展多中心、大樣本、反復驗證的基因與疾病的關聯研究，是通過對大規模群體DNA樣本進行全基因組高密度遺傳標記分型，全面尋找揭示與疾病相關的遺傳因素的方法[30]。

除了人外，表現為小耳畸形的羊等動物的GWAS檢測也為小耳畸形病因檢測提供了線索[31]。He S等通過對患有小耳畸形的羊類以及正常羊類的食道基因分型，在Oar6上發現了SNP接近HMX1基因的進化保守區域，這與其他物種如牛和大鼠的外耳先天性畸形有關。對圍繞著HMX1的進化保守區域進行測序，發現該區域的重復長度為76bp，與小耳畸形一致，提示為顯性遺傳模式[32]。另外，過去對小耳畸形羊進行的2例GWAS在同一個染色體上不同的基因上發現了顯著相關信號[33,34]。從文獻報道獲取在人、豬、羊和鼠等動物模型中與顱面部發育有關的基因匯總見表2。

表2 不同種動物中與顱面發育相關的基因Table 2 Genes associated with craniofacial development in different animals

作為一個復雜疾病，小耳畸形的病因研究困難重重。GWAS可以在小耳畸形基因組學研究中充分發揮優勢：1）無需提前選定候選基因；2）可通過家系樣本等，識別其致病基因；3）可作為診斷金標準；4）對其進行基因分型，利于產前診斷及預防。但是由于在研究設計上GWAS強調對全基因組常見遺傳變異的覆蓋率，需要足夠多患者的多代遺傳大家系或大樣本表型一致的散發患者，主要檢測人群中頻率相對較高（＞5%）的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism,SNPs），因此低頻、罕見變異可能被遺漏，并且其只對統計上與疾病最顯著相關的基因位點進行研究，從而低估基因網絡和環境因素的影響。這就需要國內外建立多中心、數據共享合作的出生缺陷監管機構，詳細地鑒別患者間的表型差異、并歸類為不同的亞型。在目前得到的GWAS基因檢測結果基礎上，依靠樣本量的增加，尋找不同樣本之間存在同一突變基因的可能性，從而獲得致病基因的鑒定。

3 拷貝數變異檢測

Balikova等在一個常染色體顯性遺傳的綜合征型小耳畸形家系中，通過連鎖分析、熒光原位雜交技術、qPCR等方法在4號染色體p16區域發現一個750kb的5次串聯重復拷貝數變異（copy number variants,CNV）[38]，這是首次在基因組結構水平觀測到小耳畸形患者存在CNV，就此CNV走進了小耳畸形研究者們的視線?？截悢底儺愂侵概c參考序列相比，基因組中≥1kb的DNA片段插入、缺失或擴增，及其互相組合衍生出的復雜染色體結構變異[39]。其形成的直接原因是DNA復制過程中發生錯誤導致復制叉中止及模板的轉換[40]，進而造成基因片段的缺失、重復、移位和倒位等，直接或間接改變基因表達的量，進而影響基因的表達[41]。例如Ana Beleza-Meireles等人對22名OAVS患者的DNA樣本進行了比較基因組雜交（comparative genomic hybridization array screening,aCGH），在22號染色體的q11區域發現了頻發劑量異常。他們猜測這些不交叉或部分交叉的CNV可能增加了OAVS的患病風險[42]。

在表3中匯總了在人所有染色體中篩選出的與先天性耳畸形相關的CNVs類型和位置，從另一個層面上豐富了小耳畸形的“優先可疑基因庫”。

表3 人類全部染色體中與小耳畸形相關的CNV[34,41]Table 3 CNV associated with microtia in all human chromosomes

目前全基因組范圍的分析主要集中在散發病例與新的拷貝數變異，策略是用大量無關病例-對照樣本的CNVs進行統計學分析，篩選可能的CNVs后再應用生物信息學分析等手段對該區域進行候選基因篩選，并用更多的具有相似表型的患者對這些基因進行突變檢測及表觀遺傳學研究來驗證?，F今的高通量芯片可以實現在全基因組范圍內檢測這樣的微缺失，使研究者能鑒定與疾病相關的染色體位點，通量高且易于實現自動化，因此針對目標區域的高效和可靠的CNV檢測是研究小耳畸形的重要手段[43]。全基因組范圍檢測的策略成本較高，由于當前CNVs分析算法還有很大局限性，易出現大量假陽性結果，需要大樣本驗證。因此檢測到的CNV位點還需要經過篩選、去除假陽性結果，然后再通過實驗證實（如熒光原位雜交、實時定量PCR、質譜等）才能確定。需要注意的是，檢測到的CNV可能只是人群中的多態現象，與患者表型并無關系，因此功能驗證是必需的。

4 小鼠基因組信息學數據庫挖掘

小耳畸形的病因學研究不僅需要發現具有統計學意義的疾病相關基因，更要揭示基因突變如何參加疾病發生的生物學機制。小鼠基因組信息學數據庫（Mouse Genome Informatics,MGI）是由Jackson實驗室主辦的免費在線數據庫和生物信息學資源庫，由美國國家人類基因組研究所（the Na‐tionaal Human Genome Research Institute,NHGRI）、國家癌癥研究所（National Cancer Insitute,NCI）等機構以促進人類健康和疾病研究為目的共同組織建立。MGI集成了來自小鼠基因組數據庫和基因表達數據庫的眾多項目[44]，收集了實驗小鼠的遺傳學、基因組學、疾病表型等海量的生物學數據，是為實驗室小鼠創建和定制的數據、工具和分析的組合數據庫。利用這一數據庫，研究人員可以相互參考數據，及時共享、更新，這些優勢可以更加便捷的推進整體實驗研究。

本文將在小鼠基因組信息數據庫（Mouse Ge‐nome Informatics，MGI,http://www.informatics.jax.org/）中檢索出的與小耳畸形相關的致病基因進行匯總，見表4。

表4 MGI數據庫中與小耳畸形相關的致病基因。Table 4 Pathogenic genes associated with microtia in MGI database

由于人鼠在分子或基因組水平上高度同源，目前多以小鼠構建疾病模型指導人類疾病機制研究。MGI數據庫包含了小鼠基因、蛋白、疾病表型等大量信息，且更新及時[43]。通過對MGI數據的分析，可以快速地獲取與小鼠耳部、顱面部發育相關的基因，還可以間接地進行功能性研究，因此作者認為表4中這些功能明確的基因對指導人類小耳畸形基因的篩選有著重要意義，可以被認為是小耳畸形的“優先可疑基因”。然而，并非全部致病基因都能被搜索并納入到研究中，MGI數據庫主要是通過疾病表型分類將一類基因進行匯總，而先天性小耳畸形的表型存在較高異質性，分類容易混淆。另外，部分研究較少的基因存在信息不準確的可能。

此外，先天性小耳畸形不僅對患病兒童造成了巨大的心理負擔，也帶給家庭和社會造成了很大的壓力，因此學者們越來越重視該病的研究，關于其新的致病基因鑒定結果將不斷涌現。這就要求研究者們緊密追蹤最新的文獻資料，及時匯總病因學研究新進展，不斷動態更新小耳畸形的“優先可疑基因庫”。在對小耳畸形的不斷研究探索中，研究者們在發現可疑位點的同時，也更加認識到了該病致病機制的復雜性。隨著遺傳學的飛速發展以及新技術的開發和應用，目前有多種尋找小耳畸形病因的方法途徑。但要想最科學合理的實現研究目的，一方面，研究者們需將多種方法整合成一個科學診斷路徑；另一方面，利用目前的鑒定結果建立一個“優先可疑基因庫”，并將檢測結果不斷納入、完善該基因庫，對就診的小耳畸形患者優先考慮這些基因的改變，使小耳畸形的遺傳學研究更加高效快捷。

本綜述將小耳畸形遺傳學檢測的4種途徑（綜合征型小耳畸形調研、GWAS、CNV檢測、MGI數據庫挖掘）組合成為一個分析路徑，并匯總出先天性小耳畸形的“優先可疑基因庫”，以方便篩選獲取更加可信、科學、合理的檢測結果。研究者們不僅可以根據本文中各個檢測方法優缺點的系統性介紹，在進行小耳畸形病因學探索時選擇最適合的檢測方法，還可以利用本文匯總出的“優先可疑基因庫”便捷的篩選可疑致病基因。但本分析路徑只是為廣大專家學者提供一種研究思路，并非唯一。值得注意的是，由于檢測原理、樣本選擇、數據集合等的多樣性，并不存在所謂的“金標準”可以對各種檢測方法獲取的結果進行比較篩選，因此需要對不同檢測方法得到的結果進行全面地匯總分析。檢測到的任何有意義的基因改變均需要通過進一步實驗驗證分析，如細胞實驗、動物模型、生物信息學分析等[45]。隨著分析技術的不斷完善，研究者們終會明確該病的遺傳學機制，并為其的防治提供理論依據和指導方向。