松材線蟲病雙基因檢測方法的建立

程維金 羅治建 陳亮 丁強 張叔勇

摘 要： 采用松材線蟲的核糖體DNA的內轉錄區序列及cathepsin L-like cysteine proteinase為目的片段設計2對引物，建立了可特異性檢測松材線蟲的雙基因PCR檢測法。利用這2對引物，松材線蟲可擴增出大小分別為490 bp及264 bp的產物，而其他對照組均無擴增。此檢測方法經過實際應用檢驗，靈敏度與常規PCR一致，而特異性更高，可以應用于實驗室的常規檢測需求。

關鍵詞： 松材線蟲;雙基因PCR;檢測方法

中圖分類號：S43?? 文獻標識碼：A?? 文章編號：1004-3020（2021）02-0060-04

Establishment of Two Gene-jointed PCR Detection Assay for

Bursaphelenchus xylophilus

Chen Weijin（1） Luo Zhijian（2） Chen Liang（2） Ding Qiang（3） Zhang Shuyong（4）

（1.Wuhan Forestry Station Wuhan 430023;2.Hubei Provincial General Station of Forest Pest Control and Quarantine Wuhan 430079;3.Wuhan Baolvfeng Biotechnology Co.Ltd. Wuhan 430048;4.Wuhan Institute of Virology，CAS Wuhan 430071）

Abstract： In this paper，a new two gene-jointed PCR detection assay to detect Bursaphelenchus xylophilus，was established.For developing the two gene-jointed PCR detection of B.xylophilus，two pairs of primers were designed according to sequence of B.xylophilus available in GenBank，targeting the cathepsin L-like cysteine proteinase gene and ribosomal DNA internal transcribed spacer region.The specificity，sensitivity assay and clinical samples were tested by using the optimized reaction system.Results showed that the specific fragments 490 bp and 264 bp were able to amplified，while there was no amplification product found in positive controls and other tested ones.The method was applied to detect clinical samples and the result showed 100 % consistence with PCR.These results could be served as a basis detection application in diagnosis of B.xylophilus.

Key words： Bursaphelenchus xylophilus;two gene-jointed PCR;detection

松材線蟲?。≒inewilt disease）是危害松屬植物的一種毀滅性病害，以松樹萎蔫病為典型癥狀，具有發病致死速度快、傳播蔓延迅速、防治難度大等特點[1]。該病由松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus引起，該病主要通過人為調運帶疫的苗木、松木制品等進行遠距離傳播，目前最主要的防治措施是通過設立和建設無病區，加強植物檢疫，嚴防病原傳入。其中，加強松材線蟲的早期診斷和檢測技術的研究尤為重要。

雙基因聯合PCR擴增是一種特殊的多重PCR擴增技術[2]。該檢測技術主要選定兩個不同的靶基因分別進行特異性引物的設計，然后同時利用兩對特異引物對反應體系進行優化、擴增，從而建立起兩個互不干預的檢測體系。雙基因聯合PCR擴增與常規PCR檢測技術相比，2個基因的檢測結果可以相互印證，有效減少了假陽性和假陰性結果的出現，具有更高的準確性。

本試驗根據松材線蟲的核糖體DNA的內轉錄區序列及基因組cathepsin L-like cysteine proteinase基因的特定區域進行兩對特異性引物的設計，并成功建立了松材線蟲雙基因聯合快速檢測體系，此檢測方法經過實際應用檢驗，靈敏度與常規PCR一致，而特異性更高，可以應用于實驗室的常規檢測。這為松材線蟲早期診斷提供了有效方法，同時為該病害的準確防治提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試線蟲及松木樣品：松材線蟲病木樣本由保綠豐（湖北）生物科技有限公司于2019年夏采集自武漢黃陂、馬鞍山森林公園等地;擬松材線蟲、腐生性線蟲病木樣本采集自武漢馬鞍山森林公園等地;

試劑：引物由華大基因有限公司武漢分公司合成。Taq DNA聚合酶、PCR產物回收試劑盒、DL2000 DNA Marker等均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

線蟲分離：新鮮采集的松木樣品，采用貝爾曼漏斗法在浸泡4～24 h后，收集前段濾液。樣品濃度不足時，濾液以1000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀溶解于少量生理鹽水中。

DNA提?。猴@微鏡下挑取單條線蟲或直接取多條線蟲混合濾液，加入100 μ1松材線蟲組織裂解液（2.5 mmol/L DTT、1.125% Tween20、0.025% Gelatin緩沖液）在冰上混勻，搗碎勻漿;55 ℃靜置15分鐘。-20 ℃長期保存。

引物設計：根據GenBank上公布的線蟲核糖體DNA的內轉錄區序列及基因組cathepsin L-like cysteine proteinase基因分別設計兩對引物，其序列為：

BxF2：5′-CGAGCAGAAACGCCGACTT-3′

BxN2：5′-AACAAACCGCAGCCAGGACTC-3′

BxCPF：5′-ACTCGGCGGTGAAACTCCAT

BxCPR：5′-CACGCGACCATCTGCTCTTC

PCR擴增：在PCR反應管中加入2 μl上述提取的組織裂解提取液、1 μl上游引物、1 μl下游引物、1 μl dNTP（10mM）、5 μl 10×Taq酶緩沖液、2U Taq酶，加ddH2O至總體積為50 μl。PCR反應條件為：94 ℃ 2 min 1個循環;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min;共 35個循環;72 ℃ 延伸 7 min。PCR擴增反應產物置于-20 ℃保存。

引物特異性驗證：分別采用基于線蟲核糖體DNA的內轉錄區序列引物對（BxF2+BxN2）及基于基因組cathepsin L-like cysteine proteinase基因的引物對（BxCPF+BxCPN），以及同時采用上述2對引物，對供試樣品經行檢測。

電泳檢測：反應結束后，取10μ1擴增產物，加入2 μl 6×DNA加樣緩沖液（含溴酚藍）混勻，在2%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠染色劑）電泳15分鐘。在紫外檢測儀下觀察、拍照。

序列測定及分析：PCR產物電泳檢測后回收，直接送樣單向及雙向測序。測序由華大基因公司武漢分公司完成。所得序列通過NCBI的Blastn進行同源性分析。

雙基因聯合PCR擴增體系實際應用：分別從武漢市各區包括武漢黃陂、江夏、馬鞍山森林公園等地采集具有松樹萎蔫病癥狀的樣本，分離線蟲后按照上述方法進行雙基因聯合PCR擴增檢測。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察

在光鏡下，松材線蟲呈蠕蟲形，蟲體細長，長1 mm左右。而腐敗生性線蟲則比較短肥。松材線蟲雌蟲尾亞圓錐形，末端寬圓，少數有微小的尾尖突。雄蟲交合刺大，弓狀，成對，喙突顯著，交合刺遠端膨大如盤。根據雌蟲的指形尾可以大致區分松材線蟲與擬松材線蟲。

2.2 PCR擴增特異性實驗結果：

基于線蟲核糖體DNA的內轉錄區序列設計的特異性引物對PCR擴增產物電泳結果見圖1。從圖中可以看出樣品在略大于264 bp處均出現一條清晰的主要擴增帶，分子量大小與預期擴增產物基本一致。

基于線蟲cathepsin L-like cysteine proteinase基因設計的特異性引物對PCR擴增產物電泳結果。從圖2中可以看出樣品在略大于490 bp處均出現一條清晰的主要擴增帶，分子量大小與預期擴增產物基本一致。

應用雙基因設計的特異性引物對對樣本進行檢測，同時檢測結果與單一PCR結果進行比較。結果顯示，雙基因PCR結果與單一PCR檢測結果一致（圖3），表明該方法可以用作雙基因同時檢測出具檢測結果。

2.4 PCR產物測序結果

基于線蟲核糖體DNA的內轉錄區序列引物對（BxF2+BxN2）及基于基因組cathepsin L-like cysteine proteinase基因的引物對的PCR擴增產物，切膠回收后，經正反向測序，均得到與預期長度一致的序列，經Blastn進行同源性分析，與預期基因相似性均為100%。

2.4 PCR擴增實際應用結果

采用PCR擴增對來自武漢黃陂、江夏八分山、武漢馬鞍山森林公園等地的樣本進行檢測，結果在武漢黃陂、江夏的樣本中均檢測到松材線蟲陽性。

3 討論

松材線蟲在我國尚未得到有效控制，目前疫區仍在不斷擴大之中。松材線蟲的傳統檢測技術具有一定的局限性，如特異性差、靈敏度低、依賴于檢測人員的經驗等等，難以對病害進行早期快速準確檢測。分子檢測技術已經逐步在各地得到一定的應用。雖然目前已經有熒光定量PCR等技術可在標準參考實驗室用于檢測松材線蟲[3，4]，但是對人員及設備均有較高要求，各地林業部門仍然急需適用于基層，具有操作簡便、成本低廉、快速準確的分子檢測技術。

基于線蟲核糖體DNA內轉錄區序列是目前PCR擴增技術主要的種類分子鑒定靶區，具有種內變異較小而種間差別相對較大等優點[5，6]，我們自行設計的引物對可以有效區分松材線蟲、擬松材線蟲及腐生線蟲;而基于基因組其它基因的擴增技術則相對研究較少[7，8]，此前，松材線蟲相關的雙重PCR技術也是根據線蟲核糖體DNA內轉錄區序列設計[9]。因此我們根據線蟲基因組cathepsin L-like cysteine proteinase基因的特定區域進行了特異性引物的設計，結合基于線蟲核糖體DNA的內轉錄區序列引物對，成功建立了松材線蟲雙基因聯合快速檢測體系。此檢測方法經過實際應用檢驗，靈敏度與常規PCR一致，可以應用于實驗室的常規檢測。

目前的松材線蟲雙基因聯合快速檢測體系，在實驗室采取的是經典的瓊脂糖電泳的方法來進行PCR產物的檢測，在今后仍然有可能通過等溫擴增及顯色、雜交等可視化技術[10，11]，實現進一步升級，以滿足現場檢測的需求。

參考文獻

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（責任編輯：唐 嵐）