扁圓吻鲴形態特征及生化遺傳特性分析

陳元元 林炳明 王衛民 Kianann Tan 張小東 宋曉然 魏晉

摘要 [目的]從形態特征、染色體核型和乳酸脫氫酶3個層面評估扁圓吻鲴種質資源狀況，為豐富鲴亞科魚類的遺傳特性資料，種質評估、種質保護及利用提供理論參考。[方法]采用傳統的形態學測量方法對60尾扁圓吻鲴的生物學性狀進行描述，采用植物血球凝集素（PHA）和秋水仙素腹腔注射腎細胞直接制片法及同工酶電泳等分子生物學方法，開展扁圓吻鲴的細胞遺傳特性及生化遺傳特性研究。[結果]扁圓吻鲴體長形，側扁，腹部圓，肛門前方無腹棱。頭小，吻突出?？谙挛?，橫裂，下頜有很發達的角質緣。鰓耙短且扁薄，排列很緊密。鱗小，體背部深黑色，腹部銀白。背、尾鰭灰黃色，尾鰭邊緣黑色，偶鰭基部黃色。鰾分二室，且后室較前室大，前室鈍圓，后室末端稍尖且呈錐狀;扁圓吻鲴的可數性狀依次為背鰭鰭式（D.Ⅲ，6～8）、臀鰭鰭式（A.Ⅱ，6～9）、側線鱗數（76～89）、鰓耙數（94～103）;其體細胞染色體數為2n=48，核型公式為18m+18sm+8st+4t，臂數（NF）為84;其不同采樣點的樣本眼睛晶狀體乳酸脫氫酶（LDH）均有5條同工酶譜帶，由LdhA、LdhB兩個基因編碼。[結論]該研究中扁圓吻鲴的形態特征與已報道的鲴亞科魚類形態特征存在一定的差異，而體細胞染色體數、核型以及乳酸脫氫酶的表達均與其他鲴亞科魚類的特征相一致。

關鍵詞 扁圓吻鲴;形態特征;核型;染色體;同工酶

中圖分類號 S917.4文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）02-0077-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.023

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Morphological and Biochemical Genetic Characteristics of Distoechodon compressus

CHEN Yuanyuan1，LIN Bingming2，WANG Weimin3 et al （1.School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan，Hubei 430056;2.Longyan Aquatic Technology Promotion Station，Longyan，Fujian 364000;3. School of Fisheries，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei430070）

Abstract [Objective]To evaluate the germplasm resources of Distoechodon compressus from three aspects of morphological characteristics，chromosome karyotype and lactate dehydrogenase，and provide theoretical basis for the enrichment of genetic characteristics，germplasm evaluation，formulation of germplasm standards，germplasm protection and utilization of D.compressus.[Method]The biological characteristics of 60 heads of D.compressus were described by the traditional morphological measurement method.The cell genetic characteristics and biochemical genetic characteristics of D.compressus were studied by the methods of PHA，colchicine and isozyme electrophoresis.[Result]D.compressus had a long body，flat side，round abdomen and no ventral edge in front of anus. It had a small head with a protruding kiss.Its mouth was located at the lower part of the head.The mandible had very developed horny margin.Gill rakes were short，flat and thin，closely arranged.The back of the body was dark black covered with small scales，and the belly was silvery white.Its dorsal and caudal fins were grayish yellow，the caudal fins had black edges，and the base of the even fins was yellow.The swim bladder was divided into two chambers with the smaller blunt and round of anterior chamber.The posterior chamber end was slightly pointed and coneshaped.The four countable characters of D.compressus were dorsal fin type（D.Ⅲ，6-8），gluteal fin type（A.Ⅱ，6-9），lateral scales（10-12），gill rake（94-103）.The chromosome number of somatic cells was 2n=48，the karyotype formula was 18m + 18sm + 8st + 4t，and the arm number （NF） was 84.LDH of eye crystal at different sampling points had five isozyme bands，which were encoded by two genes of LdhA and LdhB.[Conclusion]In this study，there were some differences of the morphological characteristics between D.compressus and Xenocyprinae，the number of chromosome，karyotype and expression of LDH in somatic cells are consistent with those of other Xenocyprinae.

Key words Distoechodon compressus;Morphological characteristics;Karyotype;Chromosome;Isoenzyme

扁圓吻鲴（Distoechodon compressus）隸屬鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鲴亞科（Xenocyprininae）圓吻鲴屬（Distoechodon），主要分布于我國福建省連城縣及臺灣省北部等地區。因其食性廣、適應性強、疾病少、人工繁殖技術成熟、肉質鮮嫩等特點，扁圓吻鲴是主養和混養的理想種類，在江河、湖泊、水庫放流可自然繁殖，是適宜放養增殖的優良品種。自20世紀50年代以來，該品種已在福建省福州、清流、寧化、長汀、永安等地區推廣養殖。此外，扁圓吻鲴屬于刮食性魚類，喜食水體中的著生藻類，在自然水體和養殖池塘中可充分利用餌料資源，有效改善水質和底質環境。為了保護這一優良種質資源，改善水域生態系統，在漁業主管部門的主導下已有不少地區開展了扁圓吻鲴的增殖放流行動。目前有關鲴亞科魚類的報道主要集中在細鱗斜頜鲴養殖技術與模式[1]、乳酸脫氫酶[2]、線粒體DNA 基因[3]的研究。扁圓吻鲴的研究報道主要集中在生物學特性、人工繁殖[4]、生態分布[5]等方面，而關于扁圓吻鲴種質研究的報道還很缺乏。筆者通過對不同水域、不同生存環境的扁圓吻鲴形態學、染色體和同工酶等基本特性進行研究，旨在為扁圓吻鲴種質資源保護、種質標準和種質鑒定提供有價值的生化遺傳參數，從而促進扁圓吻鲴這一品種的開發和利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用魚于2019年采自福建省連城縣，共60尾，體重35.2～154.7 g，體長11.67～20.13 cm。

1.2 形態特征測定

參照GB/T 18654.3—2008《養殖魚類種質檢驗第3部分：性狀測定》，采用游標卡尺（精確到0.01 mm）對60尾樣本魚進行測定?？闪啃誀畎ㄈL、體長、體高、頭長、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長、尾柄高;可數性狀包括背鰭和臀鰭的鰭式、側線鱗鱗式、鰓耙數。內部構造包括鰾和腹膜。

1.3 染色體制備

隨機選取健康的扁圓吻鲴6尾，腹腔注射植物凝集素（4.5 μg/g），24 h待肛門充血發紅后即可用于染色體制片。斷尾放血后，取出頭腎，用0.8%的生理鹽水清洗后，用眼科剪剪碎并過目篩絹網，獲得頭腎細胞懸液。用終濃度0.2 μg/mL的秋水仙素處理50 min后，離心后棄上清，在沉淀物中加入KCl溶液混勻后低滲作用30 min。離心后棄上清，使用新配制的卡諾氏液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）預固定2 min后離心，棄上清液，再加入卡諾氏液固定20 min，此過程重復3次。最后，離心后收集沉淀并加入0.5 mL卡諾氏液，制成懸液。采用4℃預冷過的載玻片進行冰凍滴片，空氣干燥;預先配制的Giemsa母液按1∶9的比例與磷酸緩沖液（pH 7.8）混合后進行染色，染色晾干后光學顯微鏡下觀察，并在油鏡下進行拍照。

1.4 染色體核型分析 參照林義浩[6]的方法，選取來自不同個體、分散良好、形態清晰的中期分裂相進行拍照計數，并計算其相對長度、臂比、染色體的分類與臂數（NF）。參照郭豐等[7]的方法進行染色體分類和分組。染色體臂數：將中部和亞中部著絲點染色體的臂數計為2，亞端部和端部著絲點染色體的臂數計為1。

1.5 組織酶液的制備 參照賀剛等[8]的方法，將扁圓吻鲴斷尾放血后取眼睛晶狀體，經4 ℃預冷的生理鹽水沖洗干凈后用濾紙吸干水分，樣品稱重后放入洗凈預冷的勻漿器內，按1∶3（g∶mL）的質量體積比添加雙蒸水，冰浴條件下反復研磨成組織勻漿液，4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min，吸取上清液，重復2次。離心后獲得的上清液用于電泳分析。

1.6 電泳及染色 乳酸脫氫酶同工酶分析采用聚丙烯酰胺梯度凝膠垂直電泳，參照孟彥等[9]的方法，濃縮膠和分離膠濃度分別為4.0%和7.5%，電極緩沖液為pH 8.3的Tris-甘氨酸緩沖液。采用10 mA電流進行預電泳，待其指示劑超過濃縮膠，將電流調節至20 mA，電泳時間為6 h。整個電泳過程在4 ℃條件下進行。

電泳結束后取出凝膠，參照余來寧等[10]的方法，室溫避光條件下染色，顯帶清晰后立刻用蒸餾水沖洗，然后拍照保存。染色液的配制方法如下：1% NAD 3 mL、6% 乳酸鈉2 mL、1% NBT 4.8 mL和1% PMS 0.4 mL。

1.7 數據統計與分析 乳酸脫氫酶同工酶以區帶數目、染色強度和相對遷移特性為指標進行分析。試驗測得的可量性狀使用SPSS 19.0軟件進行統計與分析。

2 結果與分析

2.1 外部形態特征及可數性狀和可量性狀

2.1.1 外部形態。體長形，側扁，腹部圓，肛門前方無腹棱。頭小，吻突出?？谙挛?，橫裂，下頜有很發達的角質緣。鰓耙短且扁薄，排列很緊密。鱗小，背鰭起點約在體中，與腹棱起點相對，硬刺粗壯而光滑。尾鰭深叉形。體背部深黑色，腹部銀白，體側有10余條黑色斑點組成的縱條紋。背、尾鰭灰黃色，尾鰭邊緣黑色，偶鰭基部黃色（圖1）。

2.1.2 可數性狀和可量性狀。鰾分二室，且后室較前室大，前室鈍圓，后室末端稍尖且呈錐狀，腹膜黑色（圖2）。扁圓吻鲴的可量性狀和可數性狀詳見表1，均值反映所測數據的集中程度。在可量性狀中，主要以體長和頭長為參照，測算出吻長和眼間距等頭部主要參數與頭長的比例，也包括體高、尾柄長和尾柄高等軀干部主要參數與體長的比例。在可數性狀中，側線鱗數的變化范圍最大（表1）。

2.2 染色體核型分析 選取無重疊、分散良好、長度適中且著絲粒清楚的分裂相，確定其染色體數目為2n=48（圖3）。通過測量染色體相關參數，并使用Photoshop軟件將染色體排列好（圖4），確定其組型和臂數。根據染色體的著絲點位置，可將扁圓吻鲴染色體核型分為4組：第1組有9對中部著絲點染色體（m），第2組有9對亞中部著絲點染色體（sm），第3組有4對亞端部著絲點染色體（st），第4組有2對端部著絲點染色體（t）。染色體核型為18m+18sm+8st+4t，染色體臂數（NF）為84。

2.3 乳酸脫氫酶（LDH）表達

從圖5可以看出，樣本魚眼睛晶狀體的LDH酶譜均檢測到5條LDH酶帶，其中LDH1的表達活性最強，LDH4、LDH5的表達活性相對較弱。對所得酶譜進行掃描分析，結果在樣本魚眼睛晶狀體的掃描圖中發現5個峰（圖6）。

3 討論

3.1 扁圓吻鲴的形態學比較

該研究檢測了60尾扁圓吻鲴樣本群體的形態學數據，通過與已報道的鲴亞科魚類形態特征進行比較，發現該研究結果與前人研究結果

[11]存在一定差異。究其原因，除了與樣本量以及樣本魚的規格有關外，種間差異是最大影響因素。通常在形態度量學特征上，魚類比其他脊椎動物有更大的種群內部和種群之間的變異，且這些形態變異更易受環境的影響[12]。作為獨立的生物學單元，不同種群具有不同的適應性進化潛能，其表型與遺傳特征也往往存在差異[11]。由于長期的隔離以及對它們各自環境的適應，魚類不同群體間存在顯著的形態差異是可能的。該研究數據可為扁圓吻鲴種質資源保護及種質標準的制定提供基礎資料。

3.2 扁圓吻鲴的染色體核型分析

對魚類的種質評估應結合形態特征、細胞遺傳學特征和生化遺傳學等特征進行研究。從扁圓吻鲴染色體照片分析得出，樣本中同一分裂相中最大的1對染色體的2條同源染色體屬于亞中部。這與張林等[13]報道的銀鲴等4種鲴科魚類最大的1對亞中部染色體特征相似。這表明鲴科魚類中這一對最大染色體的相對長度和臂比可能不會因羅伯遜易位、倒位、缺失或重復等而改變，反映了鲴科魚類核型的同源性。

該研究發現扁圓吻鲴的染色體數目2n=48，這與李康等[14]對扁圓吻鲴的研究結果相一致。鲴亞科和鳊亞科同屬于鯉科魚類，研究學者對鯉科魚類染色體的研究報道甚多，秦改曉等[15]認為其染色體的基本二倍數為2n=50和2n=48，變異范圍為44～200。洪云漢等[16]研究表明中國鯉科的核型為2n=50。從染色體數目來看，扁圓吻鲴與已報道的圓吻鲴、銀鲴、黃尾鲴、細鱗斜頜鲴、四川鲴、方氏鲴等[14]其他鲴亞科魚類染色體數目一致，均為2n=48，可推測鲴亞科魚類與其他許多鯉科魚一樣，染色體數目在進化上是保守的。馬綱[17]認為某一分類群大多數或絕大多數種類所具有的染色體二倍數，可作為該分類群最基本的核型特征。扁圓吻鲴與已知鲴亞科魚類[如黃尾鲴（2n=48）、銀鲴（2n=48）、細鱗斜頜鲴（2n=48）、逆魚（2n=48）等]的二倍體數一致。

除了染色體數目外，扁圓吻鲴的核型與圓吻鲴、黃尾鲴和其他鲴亞科魚類的核型不一致，圓吻鲴、細鱗斜頜鲴和逆魚的核型均為18m+26sm+4t（NF=92），銀鲴核型為20m+26sm+2t（NF=94）[14，17-18]，而扁圓吻鲴的染色體核型為18m+18sm+8st+4t（NF=88）。根據現代魚類演化的理論，染色體結構的重排可以引起NF值的變化，在2n值相同的分類群之間，臂數的變化是從進化上低位類群到高位類群的表現為逐漸升高的趨勢，即具有較多端部著絲粒染色體的類型是比較原始的，而出現較多中部和近中部著絲粒染色體的類型是比較進化的[17]。因此，從核型來看，扁圓吻鲴與圓吻鲴、黃尾鲴、細鱗斜頜鲴和逆魚的進化地位更相近，而銀鲴的進化程度更高。上述核型多態性也可能是由于魚類的不同地理種群，不同學者使用的方法不同，測量染色體的時相不一致以及測量和配組誤差所造成的。

3.3 扁圓吻鲴LDH同工酶的比較分析

基因在生物漫長的系統發育過程中也在不斷進化與變異。經過突變積累以及自然選擇作用改變了其基因調控方式，導致核苷酸序列發生變異，形成另一個基因，然而這些基因最初均來源于一個“祖先基因”。Markert等[19]對魚類LDH基因的進化進行了詳細闡述，通過進一步分析基因進化過程中LDH同工酶的分布和變化，可反映出低等無頜類到高等硬骨魚類的某些進化性的差異。吳力釗等[20]研究發現白鰱和團頭魴的胚胎發育過程中某些特異性同工酶的開始合成與發育過程中的細胞分化或器官形成時的特殊事件有關。在硬骨魚類中具有標志性的Ldh-C基因是在魚的眼睛中發現的，因此筆者以扁圓吻鲴魚的眼睛晶狀體為樣本來檢測同工酶。

LDH為四聚體酶，魚類的LDH同工酶最少有3個基因編碼，其中A、B基因所編碼的酶出現在魚類的眼睛晶狀體中。該研究在9尾扁圓吻鲴的晶狀體樣本中檢測到LdhA、LdhB基因編碼的經典5種酶帶，可用于種質鑒定。在樣本組織中未見LdhC基因的表達，說明扁圓吻鲴LDH同工酶的遺傳多樣性處于中等地位。Shaklee等[21]認為第3個基因所編碼的酶在鯉形目中只存在于肝臟中。同一物種不同組織中LDH同工酶譜存在差異，即具有組織特異性，不同亞基組成的LDH同工酶作用不同，這一特征與該組織所處的生理條件和機能有關[22]。

LDH同工酶數量與動物生活環境含氧量的狀況相關。該研究中在扁圓吻鲴的晶狀體中檢測到5條的經典酶帶，數量處于中等，由此推斷扁圓吻鲴適宜在含氧量適中、比較穩定的水域環境中生長，這可能與扁圓吻鲴在水體中下層活動生活習性有關。

4 結論通過對扁圓吻鲴的形態特征和遺傳學特性的研究發現，扁圓吻鲴形態特征與鲴亞科魚類的細鱗斜頜鲴存在一定差異。扁圓吻鲴的體細胞染色體數為2n=48，核型公式為18m+18sm+8st+4t;染色體臂數（NF）為84。其晶狀體乳酸脫氫酶有5條同工酶譜帶，由LdhA、LdhB兩個基因編碼。該研究可為扁圓吻鲴種質評估及種質標準制定提供理論參考。

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