人參內生真菌群落結構及其與有效成分相關性分析

張亞光，張艷欣，高 崎

（上海上藥杏靈科技藥業股份有限公司·上海上?！?01703）

人參為五加科植物人參 （Panax ginseng C.A.Mey）的干燥根和根莖，是我國傳統中藥材，《神農本草經》將其列為上品，認為其具有大補元氣、安神益智的功效，在現代臨床藥理研究表明，人參能夠在提升免疫力、抗腫瘤、改善心血管等多個方面發揮顯著作用[1,2]。因栽培種植方式不同，人參有林下山參和園參之分，價格懸殊，質量也存在差異。目前國內外對人參道地藥材的研究主要集中于遺傳多樣性、藥理作用以及生態環境等方面，作為一系列生理生化反應、能量與物質代謝的植物體內環境對藥材道地性的形成同樣具有重要的作用[3,4]。特別是藥材的生長發育過程中，一些次生代謝產物和有效藥用成分的累積與內部真菌介導的調節作用密切相關[5]。

田間人工種植條件下收獲的人參為園參，生長周期短，5年左右采收。林下山參的種植方式是將參籽廣播于山野林間，任其自然生長，一般稱生長年限在15年以上的為林下山參。從藥用成分含量及內生菌群落結構角度揭示二者之間的差異，對于人參栽培方式的指導、質量的控制以及市場環境的調節有一定的現實意義。人工條件下化肥和農藥的施用會對土壤的理化特征造成影響，進而改變了土壤微生物組成[6]。植物在生長過程中，和根際微生物逐步形成共生關系，所以兩者內生菌會存在差異。說明人工干預的種植過程會對藥材中內生菌為主的內環境也產生影響[7]。

人參道地藥材的生長發育過程中，一些次生代謝產物和藥用成分的累積與內部微生物介導的調節有直接關系[8]。本實驗借助LC/MS技術對兩種不同的栽培方式的人參內生真菌與人參主要藥用成分對含量相關性分析，為人參中真菌的開發和利用提供研究基礎。內生真菌與植物所構成的體內微生態系統的初步研究，以及產生的化學成分的差異和影響，將有助于從內部環境來闡釋道地人參藥材的形成機制[9]。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

植物DNA提取試劑盒、引物合成、Tap Mix酶均由生工生物技術（上海）有限公司提供；甲醇、乙腈為色譜純購自德國Merck公司；乙醇、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、次氯酸鈉均為國藥有限公司提供；實驗用標準品:人參皂苷Rg1 (批號 Z13O8L45576)、Re (批 號B10M8S35243)、Rb1(批 號Z16J9X52719)、Rc(批 號M18J9S53098)、Rd(批 號Z13N8X48155)、Rg2(批 號M17M8S31526)、Rb2(批號P09M8F35575)、Rf(批號P09M8F31017)、Rb3(批號Y05A8Y41182)購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實驗材料

本研究在遼寧桓仁縣人參種植基地 （41。03＇N，125。30＇W）進行，該地屬于中國的東北地區。共使用了10份新鮮人參樣本，根據種植方式分為兩組，5年參齡園參、林下山參各5支。從取樣區域中心位置內設5點隨機取樣[10,11]，每組5支平行樣本。搖動根以去除松散粘附的土壤，然后沖洗，直到根須上沒有可見的土壤顆粒，冷凍保鮮帶回實驗室，用于植物內生真菌18S基因分析[12]。我們將本研究中的植物共生微生物研究范圍明確為人參蘆頭下方1～3cm位置的根部去除外表皮后的內部組織中的內生真菌。

1.3 樣品的處理及DNA提取

搖動根以去除松散粘附的土壤，超凈臺內繼續用滅菌水清洗干凈樣品外表面，用無菌刀片將根莖樣品切成10×10mm的片段。取人參內部組織片段先在75%乙醇溶液中表面浸泡1 min，轉移到5%次氯酸鈉溶液中7 min，之后用75%乙醇浸泡1 min[13]。將表面滅菌的樣品用無菌水漂洗5次，并用無菌濾紙吸干。取各樣品適量，將處理過的樣品取內部組織剪碎放置研缽內，液氮研磨后置1.5 mL無菌試管中，而后用試劑盒方法提取基因組DNA。DNA樣品用瓊脂糖凝膠電泳及紫外蛋白核酸測定儀(Nano Drop one，GENEQUANT，Eppendorf)檢測質量與純度。將核酸濃度用去離子水調配到50 ng/μL，-80℃保存備用。

1.4 PCR擴增和產物純化

以上述基因提取方法分別得到供試樣品DNA，并對植物的內生真菌18S V5-V7區合成擴增引物并分別進行PCR擴增[14;15]，引物序列如下:

817F: （TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA），1196R:（TCTGGACCTGGTGAGTTTCC）；

內生真菌PCR擴增程序如下:

①95℃預變性5min；②95℃變性35s；③55℃退火35s；④72℃延伸50s；⑤步驟2～4循環25次；⑥72℃延伸5min；⑦4℃10min后終止。PCR反應在ABI ProFlex PCR熱循環儀中進行。擴增后使用凝膠法純化回收并檢驗。

1.5 高通量測序和分析

PCR反應中擴增出各DNA的18S區域，經過1.5%瓊脂糖凝膠法純化回收后，提交上海美吉生物醫藥有限公司進行測序[16]。全部序列經過濾低重復序列和嵌合體后，進行操作分類單元聚類，OTUs的相似性為97%，利用blastn將OTU序列逐條與Unite數據庫進行比對，比對的結果用于物種注釋，之后構建目水平的物種分類圖[17]。使用R的vegan package進行主成分分析（PCA），以Simpson多樣性指數進行樣品之間的多樣性分析[18]。

1.6 液相和質譜條件

色譜條件:色譜柱Waters CORTECS C18（150 mm×4.6 mm,2.7μm），檢測波長203 nm,柱溫30。C，進樣量5μL，流速1.0 mL/min，A相為0.1%甲酸-水溶液，B相為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫程序見表1所示。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution schedule

質譜條件:采用電噴霧離子源（ESI）負離子檢測模式采集質量范圍（Mass range）:50-1200 Da；毛細管電壓 （Capillary Voltage）:2.5 kV； 錐孔電壓（Sampling Cone Voltage）:30 V；離子源溫度（Soure Temperature）:120。C；去溶劑化溫度（Desolvation Temperature）:500。C；去溶劑化氣體流量 （Desolvation Gas Flow）:800 L/hr；錐孔氣體流量(Cone Gas Flow）:50 L/hr；碰撞氣:氬氣；校正液:0.5 mM甲酸鈉、2 ng/mL亮氨酸腦啡肽（Leu-enkephaline，LE），負離子模式下LE[M-H]-精確分子量以m/z 554.2615計；碰撞氣體氬氣；高碰撞能量通道:10～40 eV能量梯度。

1.7 主要成分含量的測定

1.7.1 樣品制備

取林下山參干品，粉碎，過5號篩（80目），精密稱定2.00 g，加70%甲醇20.00 mL，超聲（200 W,40 KHz）100 min，溫度50。C，濾過并棄去初濾液，精密量取續濾液10.00 mL，旋轉蒸發至干，殘渣加70%甲醇溶解并轉移至2 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22μm濾膜，即得。

1.7.2 標準曲線繪制

精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Rc對照品、人參皂苷Rd對照品、人參皂苷Rb2對照品、人參皂苷Rb3對照品、人參皂苷Rg2對照品各1.00 mg，加入甲醇溶解制成1.0 mg/mL的對照品溶液，再加甲醇逐級稀釋進樣。以濃度縱坐標，峰面積為橫坐標，得到5種人參皂含量測定標準曲線。

表2 主要成分線性方程表.Table 2 Table of main component linear equations

1.8 人參內生真菌菌群結構與人參皂苷含量的相關性分析方法

選取人參次生代謝物數據進行整理，同時對分析所得的內生菌豐度數據進行排序，采用R語言統計軟件對內生菌數據以及人參皂苷數據進行統計分析，形成相關性熱圖并得出相關性系數是否顯著(P＜0.05)。主要選擇可用于反映3種藥典中規定的皂苷檢測物（Rg1、Re和Rb1）以及2種高含量的人參皂苷檢出物（Rc、Rd）進行進一步分析?？捎糜诜从撑c人參內生真菌群落中豐度排名前20的物種的相互關系。

2 結果與分析

2.1 樣品的預處理結果以及PCR擴增結果

樣品所提取的基因調配到同一濃度后采用瓊脂糖凝膠法檢驗，基因完整性良好（如圖1）。采用適宜條件進行PCR擴增、檢測和分析，以保證后續分析結果的準確性[19;20]。樣品內生真菌擴增后可得到適宜濃度產物。

圖1 基因組DNA電泳Figure 1 Genomic DNA electrophoresis

2.2 序列統計與多樣性分析

對10支人參內生真菌的Miseq測序和聚類分析。測定得到522303條有效序列，按照97%的相似性聚成OTUs，共獲得137個OTUs。維恩圖代表樣品類群整體OTUs數目，兩組中分別含103和87個OTUs（圖2）。為比較不同產地人參內生真菌群落的多樣性，按最小序列數44146抽平 （標準化）[21]。Shannon和Chao指數越大，說明對應樣品中的真菌群落多樣性越豐富；Simpson指數則相反，指數越大，對應樣品中的真菌群落多樣性越小。多樣性指數從高到低的順序為L＞R。如表2所示，分析得出園參中內生真菌的多樣性較大。

圖2 不同栽培方式的人參內生真菌OTU維恩圖Figure 2 Venn diagram of OTUs distribution of endophytic bacterial community detected in Ginseng

表3 不同栽培方式人參內生真菌群落的多樣性分析Table 3 Diversity analysis of ginseng endophytic fungi community

2.3 人參內生真菌相對豐度分析

門水平分類學分析圖(圖3)表明樣本中，多達70%的reads屬于子囊菌門真菌，L組為林下山參，R組為園參，門水平菌群相對豐度在兩類樣品之間有所不同。同齡林下山參和園參的內生真菌組成存在差異[16,22]。對應的真菌類群涉及到7個門 （子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota、毛霉菌門Mucoromycota、纖毛亞門Ciliophora及一些相對豐度較小的門類），包括33綱、51目、62科[23]。

圖3 兩類樣品中內生真菌多樣性Figure 3 Dominant bacterial genera detected from endophytic bacterial community in Ginseng

2.5 人參內生真菌主成分分析

以兩種不同栽培方式人參樣品為目標進行PCA分析，通過對不同生境或微生物群落間的物種多樣性進行組間比較分析，探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性[24,25]。其中，林下山參位于二、三象限，園參位于一、四象限，分異性較大。通過聚類和PCA分析表明，不同栽培方式的人參內生真菌群落具有差異性。

圖4 兩類樣品中內生真菌結構PCA分析Figure 4 PCA analysis of endophytic fungal structure in two types of samples

2.6 人參化學成分含量測定結果，詳見表4。

表4 人參化學成分含量測定結果Table 4 Table of results of determination of chemical composition of ginseng

2.7 主要色譜峰的解析

人參皂苷是由人參皂苷元與糖通過-O-相連構成的糖氧苷類化合物，電噴霧電離(ESI)屬于軟電離，人參皂苷類成分在負離子模式下的ESI源中通常具有良好的離子化效率，從而得到化合物相應的相對分子質量信息。通過UPLC-MSMS技術，為化合物的結構解析提供豐富的信息。人參皂苷類成分的多級質譜裂解規律表明，在碰撞能的作用下，人參皂苷主要發生糖苷鍵的斷裂，質譜給出失去一個或多個糖的次級苷和苷元的碎片離子，從而幫助我們對人參皂苷進行解析。本研究根據ESI（負離子）檢測模式下得到的碎片離子信息，對林下山參指紋圖譜所含的人參皂苷進行解析。結果見表5。

表5 林下山參指紋圖譜共有峰的鑒定結果Table 5 Results of identification of common peaks of fingerprints of ginseng

2.8 基于人參的化學成分含量的林下山參與園參的鑒別

對林下山參和園參指紋圖譜進行對比，共得到33個共有峰。以33個共有峰的峰面積為變量，導入SIMCA-P 14.0軟件中，進行主成分分析，得到的結果如圖所示。顯示林下山參和園參樣品分布于坐標軸左右兩側，表明之間存在質量差異。

圖5 林下山參與園參的鑒別Figure 5 Differences in participating in garden ginseng under forest

2.9 化學成分和內生真菌的相關性分析

經過化學成分檢測，2種栽培方式的人參中Rg1、Rb1、Re含量均高于《中國藥典》2020年版中的人參皂苷標準。其中Rc和Rd為檢測出的含量比較高的人參皂苷。為了進一步分析與人參皂苷含量有相關性的內生真菌，此處利用Spearman相關性分析建立兩種栽培方式人參內生真菌的優勢菌屬與人參皂苷含量的多元線性回歸方程，對數據進行分組并排序后進行統計，得出相關性系數（P＜0.05），最后將內生真菌進行篩選，構建出相關性熱圖。

通過對人參內生真菌群落中相對豐度前20的組成菌屬與人參皂苷有效成分含量的相關性分析表明，部分真菌類群與5種藥用活性成分的相關性較大，特別是指標性成分Rg1、Re、Rb1。短梗霉屬、毛殼菌屬及曲霉菌屬球囊霉屬等均與藥典人參中3種藥用成分Rg1、Re、Rb1呈現含量正相關關系；子囊菌屬與Rg1、Rb1、Rc和Rd存在一定程度的負相關關系。這些結果表明，人參內生真菌群落組成與人參皂苷活性成分之間存在相關性。

圖6 人參中化學成分和內生真菌相關性熱圖Figure 6 Heat map of chemical composition and endophytic fungi in Ginseng

3 討論

植物與生長環境中接觸到的微生物互利共生，部分形成緊密共生關系。一些定殖的真菌在植物體內發揮著重要的生態功能，對植物內次生代謝物的形成起著重要調控作用，進而改變植物對環境的適應能力[26]。本研究中，園參和林下山參都與不同的內生真菌群落密切相關。種子萌芽生根后先從自身或者當地的土壤環境中，預組裝成一定特有的內生菌群，并應用于內部代謝的調節和抵抗外來微生物的入侵[27]。與園參相比，同參齡林下山參內生真菌群含有較豐富的物種與遺傳多樣性，占主要地位的四門細菌菌群相對豐度在兩類樣品之間有所不同。園參生產中施用化肥會引入外來微生物，使用農藥會對土壤環境中微生物的多樣性產生影響。林下山參和園參所使用的種子基源相同，而其中的內生菌多樣性存在差異，不同栽培環境中的差異會引起真菌組成差異。

植物內生菌是具有很大挖掘潛力的微生物資源，迄今已有眾多研究可以證實其與植物次生代謝產物的含量息息相關，一些研究發現，多粘類芽孢桿菌與人生共培養后可提高稀有皂苷含量，這就為道地藥材的深度研究提供了途徑[28,29]。本論文旨在開展道地藥材與不同品質藥材內生真菌差異研究，分析得到其種群多樣性和功能差異，可從內生菌著手闡釋道地藥材形成的相關因素加以研究。同時為通過恢復原有微生物群落解決人參連作障礙提供研究資料。林下山參和園參不同的生長環境，影響著次生代謝物的積累過程，通過對五種主要人參皂苷的含量的準確定量以及其他化合物質成分含量的比較，從化學物質含量差異揭示二者的差異。利用LC/MS技術，對化學物質成分進行進一步解析，從而明確植物內生菌與道地藥材的影響和關聯，為中藥材道地性的研究探索一條有效途徑。內生真菌種類繁多，人參化學物質成分復雜多樣，本文僅從人參皂苷與內生菌的關聯來闡釋不同栽培方式人參的差異，后續研究可以對人參揮發油、多糖、有機酸等更全面的物質基礎進行深入研究，以期更加全面解讀人參內生菌群落與栽培方式的關聯性。