實驗室大鼠超聲波的情緒意義與測量?

俞德霖 尹 彬

（福建師范大學心理學院 福建福州 350117）

大鼠（Rattus norvegicus）是生物學、醫學、心理學等學科常用的實驗動物。在使用大鼠實驗中，超聲波記錄可作為衡量其情緒狀態重要的行為學證據。

1 大鼠超聲波的分類與情緒意義

青春期和成年大鼠發出的超聲波（ultrasonic vocalizations）可分為兩大類：22 kHz 范圍的超聲波與50 kHz 范圍的超聲波[1]。22 kHz 范圍的超聲波的聲學特征是，頻率在20～35 kHz 之間，持續時間較長，可達300 ms 以上，缺乏明顯的頻率變化。50 kHz 范圍的超聲波根據聲音頻率的變化可進一步分為flat 和FM（frequency modulated）2 種：flat-50 kHz 超聲波的持續時長在10～100 ms 之間，頻率在35～50 kHz 內幾乎保持不變；而FM-50 kHz超聲波的持續時長在20～150 ms 之間，頻率在40～80 kHz 之間，具有較大幅度的波動。

實驗表明，不同的超聲波頻率可反映大鼠的某些特定行為。22 kHz 范圍的超聲波被認為反映了厭惡和恐懼等消極情緒狀態：當大鼠身邊有捕食者存在或面對攻擊性同類時，會發出22 kHz 范圍的超聲波[2-3]。在曠場、高架十字迷宮等焦慮樣行為測試中，播放22 kHz 范圍的超聲波，會讓被測大鼠有更多的防御性行為，使其大腦中與焦慮、恐懼情緒調節和防御等相關的區域（例如，杏仁核和終紋狀核）c-Fos表達增加[4-5]。而50 kHz范圍的超聲波則會在受到食物獎勵，以及和同類進行社會互動等條件下發出，例如，在藥理學實驗中注射苯丙胺和與同伴進行打鬧（playful fighting）時[6-7]。而此類超聲波的發出在神經生理上與中腦邊緣系統多巴胺能神經元的活性，以及腹側紋狀體伏隔核的多巴胺活性增加有關[8-9]。在50 kHz 范圍超聲波的2 種子類型的行為學意義上，有學者認為，FM-50 kHz 超聲波代表了一種普遍的積極情緒狀態，而flat-50 kHz 超聲波則代表了一種社會接觸（social contact）的通訊[7]?；胤?0 kHz 范圍的超聲波則使大鼠在曠場、高架十字迷宮中有更多的探索行為，在生理上能誘導釋放多巴胺，使伏隔核中c-Fos陽性神經元增加[4,10]。大鼠超聲波的回放效應也從另一個側面驗證了其情緒功能。因此，在研究中可將22 kHz 范圍的超聲波作為大鼠在實驗過程中的消極情緒指標，而將FM-50 kHz 超聲波作為大鼠在實驗過程中的積極情緒指標，通過對聲波信號的編碼，量化大鼠的情緒狀態。

2 測量方法

實驗中最好用采樣率為384 kHz 的麥克風錄制。根據采樣定理，帶通信號的最低采樣率在帶寬的2～4 倍之間[11]。在實際的實驗室操作中發現，如果僅使用192 kHz 采樣率的麥克風或采樣上限為192 kHz 的錄音軟件錄制，在頻譜圖上實際的頻率上限只能達到60 kHz 左右，雖然這對于采集22 kHz 范圍的超聲波已足夠，卻不足以涵蓋50 kHz 范圍的超聲波可能覆蓋的全部頻率范圍。因此，如果要對大鼠的超聲波進行更全面的測量，使用384 kHz 采樣率的麥克風和錄音軟件更合適。錄音軟件可使用開源軟件Audacity，這款軟件最高可達到384 kHz 的采用率和PCM 24 bit 精度的錄制。麥克風與大鼠嘴部的距離15～60 cm 為宜，距離太近（＜5 cm）容易采集到大鼠的呼氣聲、腳步聲等噪音，干擾后續的數據分析；而距離太遠（＞150 cm）則會導致收集到的聲波信號過于微弱，難以被識別。同時，還應注意消除環境背景噪音，例如，周邊的電流會產生30 kHz 的電磁干擾，可能影響到對22 kHz 范圍超聲波的識別。

圖1 展示了在實驗室采集到的50 kHz 范圍的超聲波樣本：①為FM-50 kHz 超聲波，可觀察到有明顯的頻率變化，并出現了方向相反的波峰；②為flat-50 kHz 超聲波，在波形上呈一條短平的直線。圖2 展示了在實驗室采集到的22 kHz 范圍的超聲波樣本；③為22 kHz 范圍的超聲波，持續時間接近500 ms，波形起伏不大。注意在圖1 和圖2的縱坐標軸30 kHz 處均有一條明顯的直線，即為周邊電流產生的電磁噪聲。

圖1 50 kHz 范圍的超聲波示例

在對超聲波的分析上，可將采集到的音頻使用MATLAB 進行快速傅里葉變換（FFT）生成頻譜圖（圖1、圖2），由數位經過訓練的研究者進行人工篩選，且對人工篩選結果計算評分者信度（inter-rater reliability），即數位實驗者統計結果間的 相 關 性[6]。也 可 使 用Avisoft、Ultravox 和 基 于MATLAB 的DeepSqueak[12]等自動化的分析軟件對大鼠發出的超聲波進行識別與統計。

圖2 22 kHz 范圍的超聲波示例

需要注意的是，當波形變化不大時，flat 與FM有時可能難以區分。建議遇到這種情況時，首先觀察波形，如果波形上出現方向相反的波峰，則歸到FM 中，否則歸到flat 中；其次看頻率的變化量（Δfrequency），如果頻率的變化量大于5 kHz，則歸到FM 中，否則歸到flat 中[13]。有時實驗室測量條件并不能完全消除背景噪聲（包括電磁的），仍然存在干擾，會在軟件分析上帶來很多的錯誤識別，需要在軟件分析的結果上再進行人工篩選。此外，一些噪聲可能在波形與頻率上和大鼠發出的超聲波比較接近，當從頻譜圖上無法區分時，可使用Audacity 等專業的音頻處理軟件改變音頻的速率（rate）后播放。根據人耳聽到的音色進行區分：噪音的音色比較接近金屬摩擦的聲音，而大鼠的音色比較接近鳥類的鳴叫。降低音頻的速率，既可降低大鼠超聲波的音高，使之進入人耳可聽范圍；又可讓持續時間僅10～20 ms 的超聲波更易被人識別。22 kHz 范圍的超聲波可降速至原速的20%～50%，50 kHz 范圍的超聲波可降速至原速的5%～10%。

3 應用

大鼠的超聲波在精神病學和藥理學的研究上已得到廣泛應用：例如，用22 kHz 范圍的超聲波評估大鼠焦慮或疼痛的情緒強度[14]，用50 kHz 范圍的超聲波評估大鼠愉悅的情緒強度[6]。在研究中可統計全記錄過程中出現的所有超聲波，也可對時間抽樣，統計單位時間內的超聲波。在具體量化指標的選取上，近5 年的研究以統計超聲波的次數與累計持續時間居多，通過對實驗組與對照組在聲波次數或累計持續時間上的差異檢驗藥效。

在動物行為上，大鼠的超聲波也可作為一種編碼指標。例如，當大鼠發生攻擊行為時，使用聲波可區分大鼠的攻擊是屬于侵犯性的攻擊，還是娛樂性的攻擊，從而對行為進行更精確的、帶有情緒性的編碼。與其他測量大鼠情緒的方法，例如，皮質酮、皮膚電等相比，超聲波的采集更方便，分析速度更快，并且是無創、非介入的。

還可通過對采集的聲波進行實時的快速傅里葉變換，依據頻譜圖的波形監控實驗。例如，在進行T 迷宮等學習與記憶測試之前，發現大鼠發出大量22 kHz 范圍的超聲波，可能是大鼠被實驗者抓取而處于焦慮的情緒狀態。這時可適度安撫大鼠，或等大鼠不再發出22 kHz 范圍的超聲波之后再進行實驗，有助于在學習與記憶測試中排除情緒變量的干擾。未來研究者可考慮在涉及到大鼠情緒測量的課題中，采集大鼠的超聲波進行分析。