一種簡單高效的芽胞純化方法及其效果評價

鄒 昊， 田寒友， 白 京， 王 輝， 史宇璇， 喬曉玲*

(1.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068；2.肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068)

基于菌株的生長可被特定抗生素抑制的原理，微生物法是目前應用最為廣泛的檢測食品中抗生素殘留總量的方法[1]。其中，利用嗜熱脂肪地芽胞桿菌(Geobacillusstearothermophilus)對多種抗生素敏感[2-3]、繁殖速度快和產芽胞可長期保藏等特點開發的試管擴散法已成為檢測鮮乳及其他動物源性食品中抗生素殘留總量的標準方法[4-9]?，F行的標準方法中，在制備芽胞懸液的過程中沒有將芽胞與營養體細胞分離，而是通過熱水浴((80±2) ℃，10 min)的方式將營養體細胞殺死[7]。這樣制備的芽胞懸液因含有死亡的營養體細胞，主要存在以下兩個問題：首先，因為每次制備的芽胞懸液中營養體細胞的數量都不固定，所以只能通過菌落計數的方式來確定芽胞的濃度，需要培養48 h，延長了檢測管的制備時間[10]；其次，由死亡的營養體細胞分解產生的胞壁肽等物質可誘導芽胞萌發，易導致檢測管在保藏過程中失效，縮短了檢測管的保質期[11-12]。因此，在制備芽胞懸液的過程中，對芽胞進行純化是很有必要的。國內外的學者在相關研究中也介紹了芽胞純化方法，Georget等[13-21]通過反復離心并傾倒上清液的方式去除混懸液中的營養體細胞。Finley等[22-26]在離心法的基礎上加入了酶解和超聲等環節以提高芽胞純化效率。但這些方法或多或少都存在著制備時間長、操作繁瑣以及所需的儀器和試劑較多等問題。本研究以嗜熱脂肪地芽胞桿菌為例，介紹了一種簡單高效的芽胞純化方法，應用此方法對其芽胞進行純化后，通過鏡檢等方式從純化后芽胞懸液的純度，保藏2 a后芽胞懸液的質量以及對其他芽胞桿菌芽胞的純化效果等方面對此方法進行評價，為芽胞純化方法的改進，以及進一步提高試管擴散法對食品中抗生素殘留總量的檢測性能，縮短其制備時間，延長其保質期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 嗜熱脂肪地芽胞桿菌(GeobacillusstearothermophilusCICC 10425)、嗜熱脂肪地芽胞桿菌(GeobacillusstearothermophilusCICC 10392)、枯草芽胞桿菌(BacillussubtilisCICC 20474)、枯草芽胞桿菌(BacillussubtilisCICC 20506)，由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 培養基 胰蛋白胨(LP0042)，英國OXOID公司；酵母提取物(212750)、瓊脂粉(214010)、營養肉湯培養基(23400)、營養瓊脂培養基(213000)，美國BD公司；無水葡萄糖、無水磷酸氫二鉀、四水合氯化錳(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設備 離心機(SORVALL LYNX 4000，美國Thermo Fisher Scientific公司)；電子天平(BSA822-CW，德國Sartorius公司)；pH計(PB-10， 德國Sartorius公司)；相差顯微鏡(PRIMO STAR，德國ZEISS公司)；顯微鏡彩色制冷CCD (ProgRes CF SCAN，德國JENOPTIK公司)；自然對流培養箱(BD260，德國BINDER公司)；多功能酶標儀(Synergy H4，美國BioTek公司)；生物安全柜(AIRSTREAM ClassⅡ，新加坡ESCO公司)；全溫振蕩培養箱(THZ-C-1型，太倉市豪成實驗儀器制造有限公司)；加熱磁力攪拌器(85-2，上海司樂儀器有限公司)。

1.2 方法

本研究中與菌株接觸的培養基、化學試劑、耗材和器具等均經過環氧乙烷或121 ℃，15 min的濕熱滅菌；涉及的操作，除離心、震蕩、磁力攪拌、培養、鏡檢和吸光度值檢測外，均在生物安全柜內完成。

1.2.1 菌株的復壯 根據保藏中心提供的說明書，先用100 μL的營養肉湯培養基將嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G.stearothermophilusCICC 10392)的菌種凍干粉溶解，再轉移到5 mL營養肉湯培養基中，(55±0.1) ℃培養24 h，轉接2代以恢復菌株的活力，0～4 ℃保存備用。

1.2.2 芽胞的培養 對Kim等[25]的芽胞培養方法進行了改進，培養溫度為(55±0.1) ℃，培養24 h后將平板倒置防止水分過度蒸發，培養5～7 d后，經鏡檢發現芽胞大量產生且成熟度滿足要求后，對芽胞進行采集和純化。

1.2.3 芽胞的采集 吸取20 mL，0～4 ℃的蒸餾水至培養基表面，用L形玻璃棒將培養基表面的菌苔刮落，制成芽胞和營養體細胞的混懸液并轉移到離心瓶中。

1.2.4 芽胞的純化 將離心瓶放入振蕩培養箱中，0～4 ℃，180 r/min振蕩30 min，打散混懸液中粘連在一起的營養體細胞和芽胞。然后根據本研究介紹的方法對混懸液中的芽胞進行純化。①將離心瓶放入離心機中，0～4 ℃，690 g離心30 min。②將上清液傾倒干凈。③將離心瓶傾斜，沿沒有沉淀的一側向離心瓶中緩慢加入200 mL，0～4 ℃的蒸餾水并放入磁力轉子。④將離心瓶放在磁力攪拌器上，緩慢提高轉速至600～1 200 r/min，通過使離心瓶中的蒸餾水形成的漩渦沖刷營養體細胞沉淀層，讓營養體細胞逐漸從沉淀層剝離并懸浮于水中。當芽胞沉淀層開始裸露時，緩慢降低轉速直至停止。在此過程中要保證芽胞沉淀層的完整。⑤將營養體細胞懸液傾倒干凈。⑥向離心瓶中加入200 mL，0～4 ℃的無菌蒸餾水，振蕩使所有沉淀物重新懸浮于水中。⑦重復步驟①～⑥直到芽胞純度達到要求。將制備好的芽胞懸液轉移至試劑瓶中，0～4 ℃避光保藏。

1.2.5 芽胞懸液純度檢測 首先將制備好的芽胞懸液離心(0～4 ℃，690 g，30 min)，觀察沉淀的分層情況，然后將其制成切片，在相差顯微鏡下(100×油鏡)觀察芽胞的狀態和純度。

1.2.6 保藏2 a后芽胞懸液質量檢測 將制備好的芽胞懸液在0～4 ℃的環境下避光保藏2 a后，取出制成切片，在相差顯微鏡下(100×油鏡)觀察芽胞的狀態和純度。

1.2.7 芽胞濃度標準曲線的建立 對制備好的芽胞懸液進行梯度稀釋，使用酶標儀測量其在600 nm處的吸光度(optical density at 600 nm,OD600)值，每個稀釋梯度測量3次取算數平均值，選取OD600值在0～0.8之間的稀釋梯度進行菌落計數。以OD600值為自變量，菌落數為應變量,進行線性回歸，建立基于芽胞懸液OD600值的芽胞濃度標準曲線。

1.2.8 對其他芽胞桿菌芽胞的純化效果 使用本研究介紹的方法對嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G.stearothermophilusCICC 10425)、枯草芽胞桿菌(B.subtilisCICC 20474)和枯草芽胞桿菌(B.subtilisCICC 20506)的芽胞進行純化。將制備好的芽胞懸液制成切片，在相差顯微鏡下(100×油鏡)觀察芽胞的狀態和純度。

2 結果與分析

2.1 芽胞的培養

經過5 d的培養，芽胞的成熟度如圖1所示，可見菌苔中大部分營養體細胞已經死亡且其中一部分已經自溶分解成細胞碎屑，只有少量成熟的營養體細胞。絕大部分芽胞為游離的芽胞，只有個別已萌發的芽胞。根據樊佳等[27]介紹的芽胞成熟度鏡檢評價標準，此時芽胞成熟度為Ⅴ級，可以對芽胞進行采集和純化。

圖1 培養5 d后芽胞的成熟度 Fig.1 The maturity of the endospores after 5 days of incubation

2.2 純化效果

將純化前的芽胞和營養體細胞的混懸液離心，所得的沉淀如圖2a所示，沉淀分為2層，上層呈米黃色為密度較小的營養體細胞和細胞碎屑，下層呈白灰色為密度較大的芽胞。將混懸液制成切片在相差顯微鏡下觀察發現如圖2e所示，純化前，混懸液中除了游離的芽胞外還混有很多營養體細胞、細胞碎屑和個別已萌發的芽胞。

第一次選擇性懸浮營養體細胞后，對傾倒出去的營養體細胞懸液進行離心，所得的沉淀如圖2b所示，沉淀全部呈米黃色，且未見芽胞沉淀層。將營養體細胞懸液制成切片，在相差顯微鏡下觀察發現如圖2f所示，傾倒出去的營養體細胞懸液中幾乎全部為營養體細胞及細胞碎屑，只有個別游離的芽胞混在其中。

按照1.2.4中步驟①～⑥進行1次純化后，對所得的混懸液進行離心，所得的沉淀如圖2c所示，沉淀整體呈白灰色，頂端略帶黃色，幾乎看不到營養體細胞沉淀層。將混懸液制成切片，在相差顯微鏡下觀察發現如圖2g所示，純化1次后的混懸液中大部分為游離的芽胞，但仍混有少量營養體細胞、細胞碎屑和已萌發的芽胞。與圖2e相比，盡管只進行了1次純化，但是混懸液中的營養體細胞和細胞碎屑均已明顯減少。

重復步驟①～⑥ 6次后，芽胞純度已達到本研究要求。將制備的芽胞懸液離心，所得的沉淀如圖2d所示，可見沉淀全部呈白灰色，且未見營養體細胞沉淀層。將芽胞懸液制成切片，在相差顯微鏡下觀察發現如圖2h所示，純化后的芽胞懸液中幾乎全部為游離的芽胞，只有個別已萌發的芽胞混在其中，且未見營養體細胞和細胞碎屑。

綜上所述，本方法先通過離心使混懸液分層沉淀，再通過磁力攪拌的方式選擇性懸浮上層的營養體細胞并保證芽胞沉淀層的完整，可以高效地將混懸液中的營養體細胞與芽胞分離，純化后所得的芽胞懸液純度較高。

圖2 純化過程中混懸液的變化 Fig.2 The changes in the mixed suspension during the purification processa、b、c和d分別為純化前的混懸液、傾倒出去的營養體細胞懸液、純化1次后的混懸液和純化后的芽胞懸液經離心后所得的沉淀；e、f、g和h分別為a、b、c和d對應的相差顯微鏡鏡檢圖a, b, c and d are the sediments from centrifuging the mixed suspension before purification, the vegetative cell suspension which were poured out, the mixed suspension after the first round of purification and the endospore suspension after purification; e, f, g and h are the phase contrast microscopic images of a, b, c and d

2.3 保藏2 a后芽胞懸液的質量

保藏2 a后，芽胞懸液的質量如圖3所示，此時懸液中大部分芽胞仍為游離的芽胞，只有少量已萌發的芽胞，說明通過本方法制備的芽胞懸液，在保藏2 a后，仍具有較高的質量。與圖2h相比，懸液中已萌發的芽胞數量有小幅增加。其原因可能如Kussell等[28-30]在其研究中發現的一樣，一些芽胞桿菌的芽胞具有隨機萌發的特性，即每隔一段時間，種群中就會有一小部分芽胞自然萌發以保證芽胞種群在沒有萌發誘導物質存在但適宜生長的環境下也可以正常萌發生長。

圖3 保藏2 a后芽胞懸液的質量 Fig.3 The quality of the endospore suspension after two years of storage

2.4 芽胞濃度的標準曲線

嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G.stearothermophilusCICC 10392)芽胞濃度的標準曲線如圖4所示?？梢娋鋽蹬cOD600值之間有很好的線性關系(相關系數R2=0.99)。再次說明通過本方法制備的芽胞懸液純度較高，可用檢測其OD600值的方式來取代菌落計數法，對芽胞濃度進行快速測定。

圖4 嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G. stearothermophilus CICC 10392)芽胞濃度標準曲線 Fig.4 The endospore concentration standard curve of G. stearothermophilus CICC 10392

2.5 對其他芽胞桿菌芽胞的純化效果

使用本方法制備的嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G.stearothermophilusCICC 10425)、枯草芽胞桿菌(B.subtilisCICC 20474)和枯草芽胞桿菌(B.subtilisCICC 20506)的芽胞懸液如圖5所示，可見各懸液中幾乎全部為游離的芽胞，只有個別細胞碎屑混在其中且未見營養體細胞和已萌發的芽胞。說明本方法對其他芽胞桿菌的芽胞也有較好的純化效果。

圖5 對其他芽胞桿菌芽胞的純化效果 Fig.5 The purification effects on the other Bacillus spp.a、b和c分別為使用本方法制備的嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G. stearothermophilus CICC 10425)、枯草芽胞桿菌(B. subtilis CICC 20474)和枯草芽胞桿菌(B. subtilis CICC 20506)芽胞懸液的相差顯微鏡鏡檢圖a, b and c are the phase contrast microscopic images of G. stearothermophilus CICC 10425, B. subtilis CICC 20474 and B. subtilis CICC 20506 endospore suspension prepared by using the method that introduced in this study

2.6 不同純化方法的比較

相關研究中不同芽胞純化方法所需的操作、儀器、試劑和時間如表1所示，其中離心法是目前應用最多的方法，盡管該方法操作簡單，涉及的儀器和試劑較少，但是耗時最長，大約需要4～14 d。如圖2a和2e所示，其原因在于，即使在離心力較低(690 g)的情況下，混懸液中死亡的營養體細胞、成熟的營養體細胞和體積較大的細胞碎屑仍會與芽胞一起沉淀下來，只有那些體積較小的細胞碎屑會在離心后懸浮于上清液中。所以在使用離心法時，會在較長的一段時間(4～14 d)內反復對混懸液進行離心，一方面，誘導成熟的營養體細胞在沒有營養物質的環境下逐漸死亡，另一方面，使死亡的營養體細胞在自溶酶的作用下逐漸分解成體積較小的細胞碎屑，從而通過離心的方式將營養體細胞與芽胞分離，達到純化芽胞的目的[14-17]。

Finley等[22-26]為了加快營養體細胞分解成細胞碎屑的速度，在離心法的基礎上加入了酶解和超聲等環節。盡管這樣可以明顯縮短芽胞懸液的制備時間，但同時也增加了操作的復雜程度以及所需的儀器和試劑。此外，陳振民等[31-33]在其研究中發現，酶解過程中，在營養體細胞破裂死亡并逐漸分解成細胞碎屑的同時，其細胞內的營養物質以及細胞的酶解產物(胞壁肽等)可誘導周圍的芽胞萌發，說明對混懸液進行酶解可誘導部分游離的芽胞萌發，造成游離芽胞數量的減少。Berger等[34-37]在其研究中發現，對芽胞進行超聲處理后，可在周圍環境中檢測到由芽胞核釋放的Ca2+和吡啶二羧酸(quinolinic acid, DPA)分子，同時芽胞衣外層的多種蛋白、糖肽、脂肪酸、脂酰甘油和糖脂也會隨之脫落；Gould等[38-40]發現當芽胞衣的外層結構被破壞后，其對多種酶、表面活性劑和化學殺菌劑的抗性大大減弱；Palaclos等[35]發現DPA的釋放可導致芽胞核的水合，促使芽胞萌發，且Setlow等[41-43]發現釋放到環境中的DPA分子可誘導周圍的芽胞萌發，說明對混懸液進行超聲也可誘導部分游離的芽胞萌發，造成游離芽胞數量的減少。

與其他方法相比，本方法不僅操作較簡單，所需的儀器較少，不使用任何試劑且耗時更短。

表1 不同純化方法所需的操作、儀器、試劑和時間

3 討 論

在使用本方法對芽胞進行純化的過程中發現，混懸液進行離心時，若離心力過大，會導致沉淀層過于緊實，在選擇性懸浮營養體細胞時，會出現營養體細胞不易被從沉淀層中剝離或沉淀層成塊脫落的現象；若離心力過小，會導致沉淀層過于松散，在傾倒上清液時，部分沉淀層會隨水流一起被傾倒出去，且在選擇性懸浮營養體細胞時，很難保證芽胞沉淀層的完整。純化2～3次后，會出現在傾倒出去的營養體細胞懸液中，游離芽胞的數量逐漸增多的現象，此時可適當增加離心的時間，使沉淀層更為緊實，在選擇性懸浮營養體細胞時，可以更好地保證芽胞沉淀層的完整，減少芽胞的流失。隨著純化次數的增加，有時會出現離心后已看不到明顯的營養體細胞沉淀層，但鏡檢仍可觀察到少量營養體細胞和細胞碎屑的現象，此時可通過將芽胞沉淀層表面的少量芽胞懸浮于水中并傾倒出去的方式去除剩余的少量營養體細胞和細胞碎屑。

本研究介紹了一種簡單高效的芽胞純化方法，以嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G.stearothermophilusCICC 10392)為例，應用此方法對其芽胞進行純化后，通過鏡檢等方式從純化后芽胞懸液的純度、保藏2 a后芽胞懸液的質量以及對其他芽胞桿菌芽胞的純化效果等方面對此方法進行了評價，結論如下：由于芽胞的密度大于營養體細胞，所以離心后，混懸液會分層沉淀，上層為營養體細胞沉淀層，下層為芽胞沉淀層；通過磁力攪拌的方式選擇性懸浮上層的營養體細胞并保證芽胞沉淀層的完整，可以高效地將混懸液中的營養體細胞與芽胞分離，純化后，所得的芽胞懸液純度較高；通過本方法制備的芽胞懸液在保藏2 a后仍具有較高的質量；通過本方法制備的芽胞懸液，可通過檢測其OD600值的方式快速測定其中芽胞的濃度；使用本方法對其他芽胞桿菌的芽胞進行純化，所得的芽胞懸液純度較高；與其他純化方法相比，本方法不僅操作較簡單，所需的儀器較少，不使用任何試劑且耗時更短。

本研究可以為芽胞純化方法的改進以及進一步提高試管擴散法對食品中抗生素殘留總量的檢測性能，縮短其制備時間，延長其保藏期方面提供參考。