小麥赤霉病菌拮抗菌XG-6的分離鑒定及其應用

馬東方, 盧濤, 詹闖, 金瑩瑩

1.主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心(長江大學)，湖北 荊州 434025 2.長江大學農學院，湖北 荊州 434025

在我國，小麥赤霉病是一種由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)引發的禾谷類作物重要病害[1,2]。禾谷鐮刀菌為半知菌亞門真菌，是一種常見的鐮刀菌[3-5]。因為喜溫喜潮濕的生長習性，由其內膜導致的赤霉病也廣泛分布于全球溫暖潮濕半潮濕的地區[6,7]。我國華中地區和華南地區氣候相對潮濕，十分適合禾谷鐮刀菌的生存繁殖，因此在長江中下游和江淮地區的小麥種植地區小麥赤霉病的發生尤為嚴重[8]。最近幾年，已有報道小麥赤霉病向北蔓延的趨勢有所增加，在我國西北和東北等地常有發生[9,10]。而且，隨著小麥機械收割技術的不斷提高，小麥赤霉病的發生次數更加頻繁，發病程度愈發嚴重[11,12]，對我國麥類作物生產產生巨大影響。小麥赤霉病在我國的發病比例已高達25%，我國各地小麥產區深受小麥赤霉病危害[13,14]。小麥赤霉病主要在開花期侵染小麥穗部，灌漿期致病，嚴重影響小麥產量與質量，一般使小麥減產40%～60%[15]。禾谷鐮刀菌在侵染過程中會產生主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)等毒素類的單端胞霉烯族毒素(trichothecenes)，且主要累積在小麥的麥粒中[16]，嚴重影響小麥的品質，甚至危害人畜健康[17,18]，嚴重時可致人畜死亡[19,20]。上述研究指出DON會導致小鼠中的核糖毒性應激反應，對暴露于DON的動物產生負面影響，對人畜造成危害[21-23]。

目前，田間管理與化學農藥的使用是防治病蟲草害的主要手段，但化學藥劑的長期單一化使用造成了一系列不良后果，如抗藥性增強、農藥殘留和環境污染等[24]。生物防治在解決這些問題方面發揮了關鍵的作用[25]。通過篩選針對小麥赤霉病的高效拮抗菌株研發生物防治藥劑成為研究熱點。芽胞桿菌因為其適應性強、應用潛力大[26]，在病害生物防治研究中已經取得顯著成果[27]。國內外學者已有許多關于小麥赤霉病的生防研究，篩選到的對禾谷鐮刀菌有拮抗作用的菌株多以芽胞桿菌、假單胞菌、放線菌等為主。在CHRISTIAN等[28]的研究中，生防細菌與氧化鋅納米粒子結合后可顯著抑制禾谷鐮刀菌的生長繁殖；HERRERA等[29]分離得到芽胞桿菌菌株5c，通過形成生物膜對赤霉病菌具有明顯的拮抗作用。HE等[30]從土壤中分離出小麥赤霉病的拮抗菌株，可使赤霉病病害程度顯著下降；ZHAO等[31]分離鑒定所得的菌株SG6(枯草芽胞桿菌)對禾谷鐮刀菌病菌胞子的萌發抑制率高達95.6%；李峰等[32]從小麥中分離得到HB022菌株屬于多黏類芽胞桿菌，對小麥赤霉病有顯著的防治效果；裴韜等[33]得到了枯草芽胞桿菌P72，在其細胞液中分離出的拮抗物質可顯著抑制禾谷鐮刀菌生長；辛海峰等[34]分離得到對赤霉病具有較高防治作用的萎縮芽胞桿菌菌株XM；冉軍艦等[24]從田間土壤中分離出禾谷鐮刀菌拮抗芽胞桿菌菌株7M1。上述研究表明，利用植株內分離得到的真菌對小麥赤霉病進行生物防治具有較高的應用潛力和可行性。

筆者以湖北荊州市荊州區農高區小麥赤霉病發病地區揚花期健壯的小麥植株為試驗材料，分離、篩選材料的內生菌，最終得到拮抗效果較強的內生菌XG-6，并對其拮抗譜、耐藥性等進行了研究，旨在為利用該拮抗菌株生物防治小麥赤霉病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試植株與取樣方法

選取湖北省荊州市發生小麥赤霉病田塊中的健壯小麥，采用5點取樣法整株取樣，將整株小麥樣品放入無菌袋中保存，帶回實驗室分離內生菌。

1.2 供試植物病原菌

供試的植物病原菌均由長江大學農學院植物病原真菌與基因組學研究室提供，菌株包括禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、火龍果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、白絹病菌(Sclerotiumrolfsii)和梨黑斑病菌(Alternariakikuchiana)。

1.3 內生菌的分離

將小麥的莖和葉剪成5cm左右的小段，與穗粒一起，用水沖洗30min。以下操作均需要在超凈工作臺進行。將小麥各部位切成0.5cm×0.5cm的組織塊，用75%酒精(乙醇)消毒1min，然后用4%次氯酸鈉消毒3min，再次用75%酒精(乙醇)消毒30s，最后用ddH2O清洗3遍，置于已滅菌的濾紙上吸干，每皿6塊組織塊均勻放置在PDA培養基上培養[35,36]。

1.4 拮抗細菌的篩選

圖1 離體拮抗試驗示意圖 Fig.1 The schematic of in vitro antagonism test

使用平板對峙法[37]在直徑90mm的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)平板中央接種直徑5mm的小麥赤霉病菌菌餅，按圖1所示在小麥赤霉病菌菌餅周圍接上純化后的內生菌，以空白培養基作為空白對照，每個處理設置3個重復，放入28℃等溫培養箱培養3～4d，待空白對照長滿整個培養皿時，根據抑菌圈直徑計算拮抗效果[35,36]。

1.5 拮抗菌株XG-6培養條件的研究

選用平板對峙法[37]測定拮抗菌株XG-6對4種病原真菌(白絹病菌、棉花立枯病菌、火龍果炭疽病菌、梨黑斑病菌)的拮抗作用。利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖作為碳源(碳源利用基礎培養液：(NH4)2SO42.0g，NaH2PO4·H2O 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.1g，蒸餾水1000mL，pH=7.0)，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸銨作為氮源(氮源利用基礎培養基：KH2PO41.36g，NaHPO42.13g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.5mg，CaCl25mg，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL，pH=7.0)，檢測菌株XG-6的碳源與氮源的利用情況，待其在培養基上生長3d后測定其溫度及pH生長曲線、耐藥性以及明膠液化、淀粉水解、酪蛋白水解等特征[38]。

1.6 拮抗菌株XG-6的鑒定

使用改良的CTab法[39]提取菌株XG-6的基因組DNA，并用16S rDNA的通用引物(正向引物：27F；反向引物：1492R)進行PCR擴增。將PCR產物送至南京金斯瑞公司測序，測序結果通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST比對，明確菌種種類。

1.7 培養箱條件下XG-6對赤霉病防治效果的測定

選取尺寸相同且顆粒飽滿的小麥種子進行消毒：①70%乙醇漂洗10s；②2%次氯酸鈉浸泡25min；③ddH2O清洗3～5遍。拮抗菌XG-6在PDA平板上培養至菌絲鋪滿整個培養基，然后用ddH2O洗下制成菌懸液。赤霉菌用綠豆培養基搖菌7～10d。

消毒后的種子分成3份后作為3個處理組進行試驗：①對照：使用ddH2O浸種12h，并且不接種赤霉菌；②生理鹽水+赤霉菌：使用ddH2O浸種12h，然后接種赤霉菌；③赤霉菌+拮抗菌：使用XG-6的菌懸液浸種12h，然后接種赤霉菌。催芽后在20℃、16h/8h(白天/夜晚)培養箱中培養。分別在播種第15天和第25天時統計發病苗數，并計算發病率(發病率=發病苗數/總苗數×100%)，同時稱量第25天時每盆麥苗的鮮重和干重。

2 結果與分析

2.1 拮抗內生菌的篩選

根據菌落形態的差異性，經過平板對峙法測定，從中篩選出7株對小麥赤霉病菌有拮抗作用的內生菌，經差異顯著性比較，結果顯示有差異(P<0.01)(見表1)。其中，菌株XG-6的抑菌圈的直徑達31.19mm，因此選取XG-6菌株用于進一步研究。其對小麥赤霉病菌的拮抗效果如圖2所示。

表1 分離到的拮抗菌抑菌圈直徑及其來源

圖2 拮抗菌株XG-6對小麥赤霉病菌的拮抗效果 Fig.2 Antagonistic effect of antagonistic strain XG-6 on wheat Fusarium graminearum

2.2 XG-6菌株的拮抗譜

XG-6菌株對4種供試病原菌的生長均有抑制效果(見表2)，為廣譜性拮抗菌，其中對火龍果炭疽病菌的抑菌圈直徑為35.93mm，抑制效果最好。

表2 拮抗菌株XG-6對4種病原菌的拮抗效果

2.3 XG-6拮抗菌株的培養條件

XG-6的生長曲線圖、最適溫度生長曲線圖和最適pH生長曲線圖如圖3所示。結果表明，XG-6菌株在接種到營養瓊脂培養液后的24h內為對數生長期,24～72h內為穩定期,72h后進入衰退期；XG-6菌株能在10～50℃環境下生長，適宜生長的溫度為25～30℃；XG-6菌株pH在3～10范圍內均能生長，其中適宜生長的pH范圍為6～9，pH為3時基本不生長。

圖3 XG-6的生長曲線圖、最適溫度生長曲線圖和最適pH生長曲線圖Fig.3 Growth curve, optimal temperature growth curve and optimal pH growth curve of XG-6

XG-6菌株的生理生化特征如表3所示。XG-6菌株可將蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖作為碳源，將蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸銨作為氮源，且XG-6的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨，其淀粉水解及明膠水解都呈陽性但酪素水解呈陰性。

表3 XG-6菌株的生理生化特征

2.4 XG-6拮抗菌株耐藥性測定

拮抗菌XG-6耐藥性測定結果如表4所示，拮抗菌XG-6在加入不同抗生素的培養基中培養2d后的生長情況如圖4所示。試驗結果表明，XG-6拮抗菌株對于氯霉素、氨芐西林鈉2種抗生素表現極強的耐藥性，對四環素也具有一定的耐藥性，而對鏈霉素和卡那霉素的耐藥性相對較弱。

表4 拮抗菌XG-6耐藥性測定結果

圖4 拮抗菌XG-6在加入不同抗生素的培養基中培養2d后的生長情況Fig.4 Growth of antagonistic becteria XG-6 cultured in medium with different antibiotics for 2d

2.5 拮抗菌XG-6鑒定結果

測序結果表明，XG-6菌株的16S rDNA序列含有1509個堿基。將該序列上傳至NCBI數據庫中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，進行BLAST比對，結果顯示XG-6菌株初步被判斷為芽胞桿菌(Bacillus)。根據BLAST的結果，構建系統發育樹(見圖5)。結果顯示XG-6與解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)具有93%的相似性，可以將研究所分離的菌株XG-6認定為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖5 XG-6菌株的16S rDNA序列系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of the 16S rDNA sequence of strain XG-6

2.6 培養箱條件下XG-6對赤霉病的防治效果

將實驗室篩選出的拮抗菌株XG-6施用于麥苗上，觀察其抗赤霉病的效果。蒸餾水+赤霉菌的處理在第15天和第25天時的發病率分別為56.33%和82.67%，使用XG-6+赤霉菌處理的小麥在第15天和第25天時的發病率分別為36.00%和51.67%(見圖6(a))，拮抗菌株XG-6降低了赤霉病的發病率。與蒸餾水+赤霉菌處理相比，XG-6+赤霉菌處理的鮮重質量較高，干重質量變化較小(見圖6(b))。

圖6 培養箱條件下XG-6對赤霉病的防治效果Fig.6 Control effect of XG-6 on Fusarium head blight under incubator condition

3 討論與結論

解淀粉芽胞桿菌于1943年首次在日本土壤中被發現[40]，該菌隸屬芽胞桿菌屬[41]，是一種嗜溫好氧細菌，在自然界中廣泛存在。因其繁殖速度快、生命力較強、安全性高對人畜無害并具有非常強的抗逆性等特點[42]，非常適于作為生物防治菌種，深受廣大科研人員的重視。研究表明解淀粉芽胞桿菌會產生抗菌蛋白或胞外水解酶等物質直接抑制和破壞病原菌[43,44]。一些學者認為，解淀粉芽胞桿菌會誘導寄主植物產生抗病性，進而抵抗其他病害的入侵，還有可能是因為解淀粉芽胞桿菌本身體積較大，會與病原菌競爭相應的生存空間并且其繁殖速度較快會快速搶占植物的營養物質，使病原菌無法生長。

目前有關解淀粉芽胞桿菌用于防治植物病害的研究很多，并且市場上已有了一些拮抗菌制成的商品[45]。馮志敏等[46]分離出枯草芽胞桿菌和蠟狀芽孢桿菌菌株對葡萄灰霉病具有抗性。劉仕飛等[47]分離出拮抗小麥紋枯病的細菌菌株XZ18-3。郝建安等[43]得到的NK10.BAhjaWT菌株對水稻紋枯病菌、黑曲霉、黑痘病菌等多種病原菌的拮抗作用均較好。孟利強等[48]也從大豆中分離到了菌株TF28。由此可見，解淀粉芽胞桿菌對病原菌的拮抗作用具有非常好的應用前景。

該研究從湖北省荊州市小麥赤霉病發病地區采集1株健康小麥植株，分離得到了拮抗菌株XG-6，通過16S rDNA序列鑒定為解淀粉芽胞桿菌。結果表明，該菌株對小麥赤霉病菌具有效果顯著的拮抗作用的同時，對所測試的4種病原菌(火龍果炭疽病菌、棉花立枯病菌、白絹病菌、梨黑斑病菌)都有良好的拮抗作用，具有廣譜性，且對于3種抗生素氯霉素、鏈霉素、氨芐西林鈉有極強的耐藥性。蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖可作為XG-6菌株的碳源，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸銨可作為氮源，培養條件要求相對不高，易于培養。在培養箱的條件下XG-6菌株抗赤霉菌的效果明顯。

該研究均在實驗室條件下完成，在實際生產中，XG-6產生的拮抗物質能否在自然條件下發揮良好的拮抗作用，以及拮抗菌株XG-6產生何種拮抗物質、拮抗物質的理化性質等尚不清楚，這些問題都有待進一步研究。