油茶餅粕固態發酵后養分變化

張 暉，吳雪輝，董 斌，黃永芳

（1.仲愷農業工程學院，廣東 廣州 510225；2.華南農業大學 a.食品學院；b.廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642；3.廣東農工商職業技術學院，廣東 廣州 510507；

油茶Camellia oleifera自2016年正式被國家列為大宗油料作物，油茶產量逐年增加，在種植面積、產油量、產值上均穩步提高。在南方很多產區油茶產業很快成為加快農村經濟調整的特色產業，是扶貧攻堅和鄉村振興的支柱產業[1]。

近年來油茶的研究熱點主要集中在茶油抗氧化活性、皂素提升價值等方面[2]。茶粕中的茶皂素（占10%～14%）具備抗菌消炎、抗高血壓、抗滲透和抑制酒精吸收等生物活性[3-4]。鑒于飼用的前提是茶皂素去除，過去有關油茶餅粕的飼用研究，一般首先通過微生物或物理化學的方法去除茶皂素[5]，然后才能進一步作飼用[6]。同時，針對油茶餅粕中多糖[7]和糖萜素[8]物質也有相關的提取工藝及應用研究。目前，我國每年產生的油茶籽在100 萬t 左右，剩余殘留的油茶籽粕產量為70 萬t/年[9]。如何有效利用油茶餅粕，特別是對除去了茶皂素后的油茶餅粕如何能夠更好的發揮其價值，開展一個綠色生態環保的新方向成為當前解決餅粕去向的研究熱點。油茶餅粕固態發酵用作有機肥的深度研究相對不多，常規做法是通過自然發酵處理。本研究基于前期利用哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、魯氏毛霉（Mucor roxianus）于不同環境溫度和油茶餅粕含水量下進行固態發酵研究；進一步分析固態發酵后油茶餅粕中養分變化情況，為油茶餅粕固態發酵作有機肥提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

本實驗采用的菌種包括3 種霉，分別為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）（簡稱木霉）、黑曲霉（Aspergillus niger）、魯氏毛霉（Mucor roxianus）（簡稱毛霉），均購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心，為凍干菌種。

1.1.2 油茶餅粕

實驗用的油茶餅粕購于廣東新大地生物科技有限公司，是未脫茶皂素的餅粕。

1.2 培養基配制

培養基為綜合馬玲薯培養基，1 L 培養基中含20% Potato extract（馬玲薯汁），KH2PO43 g，Vitanib B1（硫胺素）Trace 8 mg，Glucose（葡萄糖）20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，pH=6。

1.3 油茶餅粕去茶皂素處理

通過水提法脫去茶皂素的油茶餅粕。水提法是將油茶餅粕浸泡在pH=10，固液比1∶10 的80 ℃熱水中，12 h 后進行脫水，60 ℃烘干備用[10]。

已脫茶皂素油茶餅粕（簡稱油茶餅粕，下同）養分檢測[11]項的有效氮、有效磷、有效鉀結果如表1所示。

表1 已脫茶皂素油茶餅粕養分Table 1 Nutrients of non-saponinoil-teacake (Camellia) mg·kg-1

1.4 油茶餅粕發酵設置

油茶餅粕分裝到組培瓶中，每個組培瓶裝30.0 g材料，105 ℃下滅菌4 h（對照不作滅菌處理）。滅菌后加入無菌水以調節油茶餅粕含水量（40%、50%、60%、70%），分別接入菌體2 ml（105cfu/ml）于油茶餅粕中，將材料置于溫度設置20 ℃、30 ℃、40 ℃的人工氣候箱中，定期觀察菌體生長情況及油茶餅粕變化，每個處理3 個重復。

試驗分對照和添加菌種（毛霉、木霉和黑曲霉）處理，設置3 個溫度區間20 ℃、30 ℃、40 ℃，以及4 個含水量（40%、50%、60%、70%），試驗進行完全組合。

2 結果與分析

3.4 不同菌種在已脫茶皂素的茶粕發酵后主要養分變化情況

3.4.1 油茶餅粕發酵后有效氮變化

本試驗進行過程中，雖然油茶餅粕是置于封蓋的組培瓶中進行，但是由于在40 ℃時，水分仍然可以從瓶中蒸發導致油茶餅粕變干，菌種無法在油茶餅粕中正常生長，使得該溫度下的菌體無法正常生長，而如果在試驗過程中添加水分，將會導致試驗中的茶粕含水量無法達到各處理要求，所以本試驗結果不包括40 ℃的處理，此條件下可認為不適宜本方法的固態發酵。

油茶餅粕在對照以及接種毛霉、木霉和黑曲霉發酵后有效氮含量如表2所示，發酵后的有效氮含量較發酵前要高，但對照處理在20 ℃、含水量70%條件下的有效氮含量損失最多，只有821.1 mg/kg，比發酵前有效氮含量降低了29.28%。油茶餅粕在接種黑曲霉，在20 ℃、含水量60%條件下，其有效氮含量達到1 596.0 mg/kg，比發酵前油茶餅粕有效氮含量提高了74.31%，是20 ℃所有處理中，有效氮含量最高的處理，其比同溫度、含水量條件下的對照處理高94.37%。在30 ℃下，接種黑曲霉的處理在含水量40%和50%時其有效氮分別比發酵前增加83.33%和69.72%，分別比對照高56.94%、15.94%。其中黑曲霉+溫度30 ℃+含水量40%處理組發酵后有效氮含量為本試驗處理中有效氮含量最高。

表2 油茶餅粕固體發酵后有效氮變化?Table 2 Available nitrogen changes after oil-tea cake (Camellia) fermentation

對有效氮進行方差分析（表3）可知，菌種、溫度、含水量顯示出極顯著差異，但互作效應菌種×溫度、菌種×含水量和菌種×溫度×含水量差異不顯著。

表3 油茶餅粕有效氮方差分析及水平間Duncan’s 檢驗?Table 3 Analysis of available nitrogen variance and Duncan’s test between levels

從各因素水平間的鄧肯檢驗結果，黑曲霉和毛霉處理與對照之間有效氮含量差異極顯著，黑曲霉與毛霉之間差異極顯著；含水量40%、50%與70%之間的有效氮含量差異極顯著，但含水量60%與70%之間的有效氮差異不顯著；雖然溫度在40 ℃時已無法順利開展試驗，但是30 ℃和20 ℃兩個溫度組之間有效氮含量表現極顯著差異。從有效氮含量的分析結果來看，對于有效氮的保留和轉化的優勢組合為黑曲霉+溫度30 ℃+含水量40%組合以及黑曲霉+溫度30 ℃+含水量50%組合，其在本試驗中有效氮含量分別為1 678.60、1 554.00 mg/kg，為發酵前原料有效氮含量的1.83、1.70 倍。

3.4.2 油茶餅粕發酵后有效磷比較

油茶餅粕發酵前有效磷含量為822.00 mg/kg，大部分處理的有效磷含量都高于1 000 mg/kg（表4）。其中，提高幅度較大的優勢組合為接種毛霉和木霉處理，毛霉+溫度30 ℃+含水量50%處理組有效磷含量最高，為1 386.93 mg/kg，比油茶餅粕發酵前有效磷含量增加68.73%，次優組合為木霉+溫度20 ℃+含水量70%以及木霉+溫度20 ℃+含水量60%組合，兩組合有效磷含量分別為1 361.83 和1 243.85 mg/kg，比發酵前增加65.67% 和51.32%，比對照高17.60%、6.10%。在30 ℃時，含水量70%條件下各處理中有效磷含量較發酵前變幅較小，其中，毛霉+溫度30 ℃+含水量70%處理組有效磷含量與同條件下黑曲霉處理組相似，其有效磷含量比發酵前只增加14.80%，為本試驗處理中有效磷含量最低處理組。

表4 油茶餅粕固體發酵后有效磷變化?Table 4 Available phosphorus changes after oil-tea cake (Camellia) fermentation

對油茶餅粕有效磷進行方差分析（表5），菌種、含水量、菌種×溫度、菌種×含水量、溫度×含水量互作效應有效磷差異性呈極顯著，而溫度及菌種×溫度×含水量互作效應有效磷差異不顯著。

表5 油茶餅粕有效磷方差分析及水平間Duncan’s 檢驗?Table 5 Analysis of available phosphorus variance and Duncan’s test between levels

在溫度水平間鄧肯檢驗（表5）顯示，黑曲霉與木霉、對照處理的有效磷含量差異顯著，而對照與木霉和毛霉之間差異不顯著。從菌種因素效應來看，均值高低排列為木霉＞對照＞毛霉＞黑曲霉，其中木霉處理后的油茶餅粕有效磷均值最高，為1 172.38 mg/kg，在對照組處理中，有效磷含量最高時條件為溫度30 ℃+含水量50%，其有效磷含量為1 240.3 mg/kg，分別比同條件下毛霉和黑曲霉處理高15%和20%。20 ℃和30 ℃之間有效磷差異不顯著。含水量50%與70%差異顯著，但40%、50%和60%之間有效磷含量差異不顯著。

3.4.3 油茶餅粕發酵后有效鉀比較

油茶餅粕發酵前有效鉀含量為6 681.7 mg/kg，發酵后大部分處理的有效鉀含量均比發酵前高（表6）。其中，增加幅度較大的是木霉和黑曲霉處理組，其中處理組黑曲霉+溫度30 ℃+含水量60%的有效鉀最高，為8 509.4 mg/kg，比發酵前和同條件下對照處理分別高27.35%和28.61%，次優處理組為木霉+溫度20 ℃+含水量50%以及黑曲霉+溫度30 ℃+含水量50%，有效鉀含量分別為8 313.5 和8 183.0 mg/kg，比發酵前增加24%和22%，而處理組毛霉+溫度20 ℃+含水量70%油茶餅粕有效鉀含量最低，比發酵前減少7.80%，為6 159.5 mg/kg。

表6 油茶餅粕發酵后有效鉀含量?Table 6 Available potassium changes after oil-tea cake (Camellia) fermentation

對有效鉀進行方差分析（表7）可知，菌種、含水量單因素效應和互作效應菌種×溫度、菌種×含水量和菌種×溫度×含水量中處理后有效鉀含量都顯示出極顯著差異，而溫度、溫度×含水量效應差異不顯著。

表7 油茶餅粕有效鉀方差分析及水平間Duncan’s 檢驗?Table 7 Analysis of available potassium variance and Duncan’s test between levels

從菌種因素各水平間鄧肯檢驗結果來看（表7），黑曲霉、木霉與毛霉、對照之間有效鉀含量差異性顯著，而黑曲霉、木霉間有效鉀含量差異不顯著，毛霉與對照間有效鉀含量差異不顯著。對比表6有效鉀均值結果含量，黑曲霉和木霉相對于對照處理有效促進了油茶餅粕有效鉀增加。

20 ℃和30 ℃之間有效鉀含量差異性不顯著。本溫度設置水平不是油茶餅粕有效鉀起作用的因素。而從有效鉀效應均值來看，30 ℃均值高于20 ℃。含水量50%、40%、60%與70%之間有效鉀含量差異性顯著。從表7可推出較優組合分別為黑曲霉+溫度30 ℃+含水量60%、黑曲霉+溫度30 ℃+含水量50%、木霉+溫度20 ℃+含水量50%、木霉+溫度30 ℃+含水量40%，油茶餅粕有效鉀含量分別較發酵前增加了27%、23%、24%、21%。

3 結論與討論

3.1 結 論

黑曲霉與毛霉在油茶餅粕發酵后其有效氮均有明顯的提高，并且黑曲霉相對優于毛霉，而在溫度上，30 ℃效應有效氮均值比20 ℃要高，4 個含水量中40%比其它3 個含水量更有利于發酵后有效氮的提高，其最優組合為黑曲霉+溫度30 ℃+含水量40%、黑曲霉+溫度30 ℃+含水量50%，此組合有利于黑曲霉對油茶餅粕有效氮的轉化和保留。從有效氮結果來看，黑曲霉的使用有利于油茶餅粕固態發酵，其次為毛霉。

毛霉、在30 ℃下、含水量50%條件下有效磷均高于各自其它水平。關于有效磷在固態發酵過程中的變化，出現不同的研究結果。尹永強等[12]研究結果表明在堆肥過程中有效磷含量變化呈現增加的趨勢。Keeling 等[13]認為是有機物的分解產生了有機酸和腐殖質，這些物質由于具有酸性或含有大量酸性基團，從而具有較強的溶解難溶磷的能力。本試驗中菌種、溫度、含水量效應組合顯著，結合實驗中有效磷可推出較優組合（毛霉+30 ℃+含水量50%）。

以往的研究結果顯示在堆肥過程中速效鉀含量呈現增加的趨勢。油茶餅粕發酵后有效鉀的結果變化中3 種真菌及對照處理中除個別處理出現發酵后有效鉀比發酵前稍低外，其它都比發酵前有明顯增加。結果顯示在20 ℃與30 ℃下黑曲霉與木霉對油茶餅粕發酵后有效鉀增加作用明顯，并且遠優于對照組處理。

綜上分析，本研究選出有利于油茶餅粕發酵的菌種為黑曲霉或木霉、溫度30 ℃、油茶餅粕含水量為40%或50%時進行固態發酵利于其進一步作為有機肥應用。

3.2 討 論

目前油茶的研究主要集中在育種、食品與化學等方面[2]，如對抗旱性油茶品種的篩選[14]，在副產品應用上，研究關于果殼對Al3+和Ca2+的吸附性能[15]，但對于副產品之一的油茶茶粕的利用研究還是停留在以前的傳統認識。油茶餅粕中茶皂素的存在是限制其直接固態發酵的因素之一，未經處理的油茶餅粕常含有12%～13%的茶皂素，關于茶皂素對微生物的抑制作用已有相關研究，黃衛文等[16]用溶劑法提取油茶枯餅中的皂素對大腸桿菌、桔青霉等6 種真菌進行了抑菌試驗，其結果均表明具有抑制作用。茶皂素是一個經濟價值較高的日化原料。茶皂素對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌具有明顯抑制作用[17]。茶皂素的抑菌機制是通過破壞菌本的正常形態，改變細胞膜和細胞壁的透性，破壞其阻隔性，導致堿性磷酸酶和細胞內容物如K+、蛋白質外匯來實現[18]。因此，有必要考慮油茶餅粕在未脫茶皂素前提下作固態發酵有可能受到阻礙。同時，在本試驗中單獨用油茶餅粕固態發酵作有機肥，在含水量70%時已經使茶粕處于粘稠狀態，不利于微生物的好氧性生長，使得茶粕處于一種厭氧發酵狀態，其不利結果是使得氮元素含量損失。

前期工作中[19]已經證明魯氏毛霉M.roxianus、哈茨木霉T.harzianum和黑曲霉A.niger3 種菌未脫茶皂素與已脫茶皂素的油茶餅粕中生長對比，經過30 d 的觀察，結果表明3 種霉菌在未脫茶皂素油茶餅粕中起始生長較慢，其菌絲未能完全遍布到油茶餅粕，在含水量為60%和70%油茶餅粕中會出現黃色油狀層；然而，3 種霉菌在已脫茶皂素油茶餅粕中生長較快，其中含水量40%、50%和60%處理中菌絲均能布滿在茶粕中。油茶餅粕如果用于固態發酵有機肥，從微生物生長角度考慮[20]，應該采用已脫茶皂素作為發酵材料。同時，由于茶皂素具有非常高的經濟價值，茶油生產廠家一般也會經過下游工廠先對油茶餅粕作茶皂素提取再作進一步利用，這也是提高油茶產業鏈產值的有效方式之一。

氮素的轉化過程涉及氨化、硝化、反硝化、揮發等共同作用，并受微環境中氧濃度的影響[21]。在通過發酵處理過程中，氨態氮的轉化直接影響到發酵后有效氮的含量，以及整個肥料的肥效。同時，由于傳統堆肥腐熟過程是涉及多種自然微生物參與的生理生化過程，而對于油茶餅粕材料來說，其蛋白質含量偏高，氮元素高于其他堆肥材料，如果采用自然發酵方式，則需要考慮多種微生物處理下可能產生的臭氣。因而如果利用添加外源微生物來加速該過程，并調控堆制過程中的碳氮代謝，則可通過人為措施極大減少氮類物質分解和臭氣的產生。林天杰等[22]采用雞糞和菜籽餅2 種有機肥進行好氣和好氣+厭氣2 種方式發酵稻草,各養分速效態含量除氮外均因發酵而增大，在堆肥的過程中出現氮素的損失也是堆肥過程中不可避免的結果；為減少氮的損失，趙京音等[23]通過添加微生物制劑EM 來提高堆肥中有機物質和氮素的保留率，減少氮的氣態損失。本試驗中的油茶餅粕是在有限密閉環境中進行，對有效氮的保留起到一定的作用，試驗結果也說明人為添加菌種較其自然發酵更有利于速效態養分的保留和增加，關于油茶餅粕在土壤中的積累過程中對微生物菌群的影響，特別是未脫茶皂素的油茶餅粕，茶皂素的含量一般達到13%，如果將其直接作有機肥施用于田間或林地育苗，茶皂素對土壤微生物的影響還未有研究，對小苗的生長作用在未來可做進一步研究。油茶茶粕由于蛋白質含量高，其作為有機肥應用時也應考慮如何與其他植物廢棄物如園林植物廢棄物在最適比例混合發酵以使土壤處于更健康狀態。本文的下一步工作將在茶粕與其它有機原料混合發酵下展開研究，以達到更好的肥效和更均衡的植物促進作用。