氧化應激對家禽卵泡閉鎖的影響及機制

王建萍 張克英

(四川農業大學動物營養研究所，動物抗病營養教育部重點實驗室，動物抗病營養農業農村部重點實驗室， 動物抗病營養四川省重點實驗室，成都611130)

我國是世界上最大的蛋雞飼養國，商品蛋雞雖然產蛋性能在高峰期已經達到最大，但是其使用年限短，全期產蛋率并不高，仍然具有巨大的繁殖和生產潛力。而如何提高商品蛋雞產蛋率，延長生產周期，從而緩解環境壓力，這些都是生產上亟待解決的問題。正常情況下，家禽的卵巢中僅有1‰的卵泡能最終發育成熟并排卵，大多數卵泡發生閉鎖。與哺乳動物不同，蛋雞的卵泡閉鎖一般主要發生在初級卵泡和前等級(小白、大白和小黃)卵泡階段，其發生一般是通過凋亡、自噬和其他未知途徑死亡，其中以凋亡為主[1-2]。研究發現卵泡內一定量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)對卵泡發育和排卵具有重要的生理作用，然而ROS的過度堆積會引起氧化應激，誘導卵泡閉鎖，造成繁殖性能衰退[3-4]。對于產蛋雞而言，隨著集約化程度的提高，產蛋或其他應激因素(熱應激、霉菌毒素、重金屬等)可引起氧化應激，進而導致卵泡閉鎖，這可能是降低蛋雞全期產蛋率和生產潛力的根本原因，而氧化應激是多種應激因素損害繁殖性能的共同機制。因此，探討氧化應激導致卵泡閉鎖的機制對挖掘家禽生產性能有重要理論和實踐意義。本文針對氧化應激對卵泡閉鎖的影響及機制進行綜述，旨在為家禽卵泡閉鎖機制的研究提供理論依據，也為繁殖學的理論研究和人類卵巢疾病研究提供科學的參考。

1 家禽卵泡的命運

家禽在孵化時擁有約480萬個原始卵泡，但終生僅排卵500～1 000個，不足1‰，還具有巨大的生產潛力。與哺乳動物類似，家禽的原始卵泡主要存在3種命運(圖1)[5]：第一，維持靜默狀態，構成原始卵泡庫(primordial follicle reserve，PFR)；第二，在外部因子(各類繁殖激素、生長因子、細胞因子等)的刺激下原始卵泡被激活，發育成初級卵泡、前等級卵泡[直徑1～8 mm：包括小白卵泡(SWF，直徑<1 mm)、大白卵泡(LWF，直徑2～5 mm)、小黃卵泡(SYF，直徑5～8 mm)、大黃卵泡(LYF，直徑9～12 mm)]和等級卵泡(按體積大小分別為F1～F7)，并發育成熟和最終排卵，若遇應激和疾病等因素導致發育受阻，則會發生卵泡閉鎖；第三，靜默狀態的原始卵泡經歷細胞凋亡、自噬或其他未知途徑死亡，形成卵泡閉鎖[2]。卵泡閉鎖是指卵泡及其中的卵母細胞在發育過程中停止生長并逐漸退化的現象。成熟卵泡主要由卵黃、卵母細胞、顆粒細胞層和膜細胞層(圖1)等組成。由于家禽和哺乳動物一樣，在出生后缺乏生殖干細胞[5]，因而其在胚胎發育時期所建立的原始卵泡庫是出生后生殖細胞的唯一來源，而卵泡閉鎖的數量直接影響家禽產蛋率的高低。

圖1 原始卵泡的3種命運

2 氧化應激可以導致卵泡閉鎖

氧化應激(oxidative stress)是指機體在內外環境各種有害刺激下，體內產生的ROS和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)過多，超過機體自由基清除能力，從而引起細胞和組織器官損傷的現象。研究發現氧自由基的過度堆積會引起氧化應激，造成繁殖性能衰退[3-4]。ROS是細胞通路的重要調控分子，能調控細胞周期和細胞凋亡[6]。已有研究表明，卵泡內一定量的ROS對其發育和排卵具有重要的生理作用[7]，然而ROS過度升高將會導致氧化應激，誘導卵泡閉鎖[3,8-9]。在哺乳動物上的研究發現，氧化應激會降低卵巢各階段卵泡數量，損傷卵巢功能[10-14]。有研究發現添加抗氧化劑(如茶多酚提取物)可以緩解由金屬鉬和鎘誘導氧化應激時卵泡數量的下降[15-16]，在哺乳動物上的研究也發現已知的強抗氧化劑(原花青素、沒食子酸、維生素E、白藜蘆醇)可以緩解顆粒細胞的凋亡[17-19]，進一步說明了氧化應激與卵泡閉鎖關系密切。

3 氧化應激導致卵泡閉鎖的機制

卵泡主要由卵母細胞、顆粒細胞層和膜細胞層組成，是卵巢的基本功能單位。目前的研究表明，氧化應激可以導致顆粒細胞和卵母細胞的凋亡，并均可導致卵泡閉鎖[2,20]，其中關于顆粒細胞介導的卵泡閉鎖的研究較多，也更為深入。

3.1 顆粒細胞介導的卵泡閉鎖機制

顆粒細胞通過間隙連接與卵母細胞相連，可以與卵母細胞進行物質交換，對卵母細胞靜默、激活和死亡等命運起決定作用。前人研究證實，顆粒細胞的凋亡是引起卵泡閉鎖的根本原因，當顆粒細胞凋亡數量達到10%時，標志著卵泡進入閉鎖狀態[5]。目前的研究發現氧化應激可以引起顆粒細胞凋亡[21-25]。

顆粒細胞凋亡是一個各種信號傳導系統參與的復雜生理生化反應過程，包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑[26-27]。第1條途徑由線粒體介導，細胞色素c(cytochrome c，Cyt-c)從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟。釋放的Cyt-c與細胞凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor,AIF)結合，并與半胱天冬蛋白酶(cysteine aspartate-specific protease，Caspase)9結合形成凋亡小體[Cyt-c/d ATP/凋亡酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)]，進而招募、激活下游凋亡執行者Caspase 3和8。而被激活的Caspase裂解細胞內重要的參與細胞功能調控和修復DNA的蛋白，如細胞骨架調節有關蛋白和DNA修復酶聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)，最終引起細胞凋亡[28]。第2條途徑為死亡受體途徑，主要參與因子為Fas/FasL、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，最終線粒體途徑和死亡受體途徑都可以通過Caspase 8和10的激活，再進一步激活Caspase 3來誘導細胞凋亡。而第3條途徑為內質網途徑，主要機制是內質網應激(蛋白質錯誤折疊或未折疊、內質網脅迫)導致Caspase 7和12的激活，并進一步激活Caspase 9，促進細胞凋亡的發生[29-30]。此外，B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族中的促凋亡蛋白[如Bcl-2相關X蛋白(Bcl2-associated X protein，Bax)、Bcl-2同源拮抗劑(Bcl-2 homologous antagonist/killer，Bak)、Bcl-2樣蛋白11(Bcl-2 protein like 11，Bim)等]和抗凋亡蛋白[Bcl-2、B細胞淋巴瘤-xL(B-cell lymphoma-2 xL，Bcl-xL)和髓樣細胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)]是參與調控細胞凋亡的關鍵蛋白。在小鼠模型上的研究表明，氧化應激可以提高小鼠卵巢ROS和丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度，引起卵泡閉鎖，降低小鼠卵巢中各階段卵泡數量[31-33]。另外，叉頭轉錄因子1家族成員叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1，FoxO1)是促使卵泡閉鎖和顆粒細胞凋亡的關鍵因子[34]，可以通過調控促凋亡基因TRAIL、FasL和p53上調凋亡調控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA)的表達，促進細胞凋亡[35-36]。研究表明，氧化應激可以引起顆粒細胞內FoxO1的高表達，從而調控其下游基因，引起顆粒細胞凋亡。而磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3-K)受FoxO1的調控，Wang等[37]研究證明卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)可以通過下調蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)-PI3K-蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)-FoxO1軸緩解顆粒細胞凋亡。劉澤群[38]研究表明，氧化應激[過氧化氫(H2O2)處理]可以導致卵巢顆粒細胞凋亡，此過程是通過c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/FoxO1/PUMA信號通路來實現的。另外，也有研究表明，在順鉑治療卵巢癌過程中JNK也可激活PUMA導致卵巢癌細胞發生凋亡[39]。其他研究也發現PUMA可以通過下調下游抗凋亡蛋白(Mcl-1和Bcl-xL)基因的表達，從而促進由順鈀誘導的卵巢癌細胞的凋亡[40-41]。此外，Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路也被證明是調節卵泡生長、發育和成熟的一個關鍵途徑，可以調節顆粒細胞的增殖和凋亡，該通路受損時，會導致抗穆勒氏管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)表達下降，導致卵母細胞提前成熟，原始卵泡庫耗竭，從而引起哺乳動物卵巢早衰[42]。Wang等[43]研究發現，家禽閉鎖卵泡中參與Wnt4的信號通路的基因弱于其他優勢卵泡，進而表明Wnt4信號通路參與了家禽卵泡閉鎖。

此外，近年來的研究發現自噬也參與了卵泡閉鎖的過程。自噬是真核細胞中高度保守的自我更新過程，其特征是將細胞質物質吞噬到雙膜囊泡(自噬體)中，隨后在溶酶體中降解[44]。通常，自噬機制對于清除功能障礙的蛋白質和細胞器是必不可少的[45]，但過度自噬也會導致細胞死亡[44]。研究表明，具有正常ROS產生量的哺乳動物細胞通常表現出基礎自噬活性，而過度自噬可誘導遭受氧化損傷的細胞自我毀滅[46]；進一步研究證明，在卵泡閉鎖期間，卵泡顆粒細胞中自噬信號升高[47-48]。Shen等[25,49]和Lou等[50]研究表明，氧化應激可以通過激活FoxO1依賴的PI3K-AKT-FoxO1軸和目的沉默信息調節因子1(silent information regulator 1,SIRT1)-FoxO1-自噬相關蛋白7(autophagy related protein 7，ATG7)軸以及抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian or mechanistic target of rapamycin complex 1,mTORC1)和促進p53信號通路導致鼠顆粒細胞自噬，進而引起卵泡閉鎖。氧化應激還可以通過JNK的激活促進自噬關鍵蛋白Beclin1的表達，進而誘導顆粒細胞自噬[51]，而SIRT1已經被證明在卵巢中大量存在，且與卵巢的抗氧化和衰老密切相關；并且，研究進一步發現褪黑素可以通過抑制JNK/Bcl2/Beclin1信號傳導，也可以通過抑制SIRT1信號通路，來抑制顆粒細胞因氧化損傷而導致的自噬[25,32,51]。Kang等[52]通過3-硝基丙酸構建鵝顆粒細胞氧化應激模型，研究發現，抑制Bcl-2會促進Caspase3基因的表達，從而引起鵝顆粒細胞自噬和凋亡。Li等[14]研究發現，熱應激引起的氧化應激可以通過死亡受體通路(FasL-Fas和TNF-α)引起細胞凋亡，進而降低蛋雞的產蛋率。

3.2 卵母細胞凋亡介導的卵泡閉鎖機制

家禽卵母細胞是卵泡內最大的細胞，被顆粒細胞和膜細胞包裹，卵母細胞的凋亡也是導致卵泡閉鎖的主要原因[53]。人和模型動物上的大量研究表明，ROS的大量產生或抗氧化系統的失衡會導致卵母細胞凋亡，是減少卵泡儲備的重要原因[54-56]。有研究表明，由氟化物引起的氧化應激可以導致卵母細胞發生凋亡，損傷卵巢功能。Luan等[57]和Nguyen等[58]研究發現，cyclophosphamide或cisplatin(常用的癌癥化療藥物)會通過線粒體凋亡途徑(Cyt-c-Bax/Bcl2-Caspase)引起卵母細胞凋亡，減少原始卵泡的數量。Nguyen等[58]和Myers等[59]進一步研究發現，促凋亡蛋白PUMA及其上游關鍵信號Tap63(p63)是參與癌癥治療藥物(cyclophosphamide、cisplatin、doxorubicin)，可導致線粒體途徑的卵母細胞凋亡，并最終降低原始卵泡儲備的關鍵信號通路[57,60]。

另外，人及模型動物上的研究表明，卵母細胞的自噬也參與了哺乳動物青春期卵泡大量閉鎖[61]。卵母細胞可以經歷多種形式的程序性死亡途徑[62-63]：1)自噬的誘導促進了凋亡的發生；2)自噬和凋亡共同發生，促進細胞程序性死亡。Xu等[64]通過研究發現，沉默信息調節因子2(silent information regulator 2，SIRT2)失活是卵母細胞衰老的關鍵機制，而SIRT2的抑制作用有助于成熟后卵母細胞的自噬依賴性細胞凋亡；已有研究也發現SIRT1信號通路參與了氧化應激誘導卵泡閉鎖的過程，激活SIRT1信號通路有助于卵泡的存活[63,65-66]。因此，在出生后卵母細胞死亡介導卵泡閉鎖的機制在不同的時期中可能有不同的途徑，但家禽上氧化應激對卵母細胞凋亡機制的研究相對缺乏，有待進一步研究。

4 抗氧化劑對卵泡閉鎖的影響

抗氧化劑是清除過量ROS的清除劑，有助于維持機體的氧化/抗氧化劑平衡，包括酶類抗氧化系統和非酶類抗氧化系統[51]，后者主要由天然和合成的抗氧化劑構成，包含維生素C、維生素E、植物多酚(茶多酚、白藜蘆醇、槲皮素等)等[34,51]。近年來，大量模式動物上的研究表明，在癌癥治療以及卵泡體外培養過程中，使用抗氧化劑可以提高卵泡的存活和卵巢的功能[16,37]。

茶多酚是茶葉里面的主要多酚類活性物質，已被證明具有強抗氧化和抗凋亡活性[67]。研究表明注射或者口服茶多酚均可以降低卵母細胞的凋亡和卵泡閉鎖，并增加原始卵泡庫的數量，從而延緩小鼠卵巢的衰老[16,68]。體外試驗進一步揭示茶多酚中的表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)可以通過PI3K-AKT信號通路降低腔前卵泡閉鎖[69]。本實驗室的前期研究也表明，飼糧中添加茶多酚可以緩解過渡金屬鉬和釩引起的氧化應激，提高蛋雞產蛋率和雞蛋抗氧化性能[15,70-71]。

白藜蘆醇是研究最多的天然多酚類化合物之一，存在于70多種植物和紅酒中，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和延緩衰老等作用[72]。最近大量研究表明白藜蘆醇可以緩解氧化應激，降低卵泡閉鎖，增加原始卵泡數量，進而延緩卵巢壽命[16,73-75]。Jiang等[75]在小鼠卵巢早衰模型中的研究發現白藜蘆醇可以緩解卵巢早衰導致的卵巢氧化損傷和卵巢炎癥，并且發現其作用機制與hedgehog(Hh)通路相關。另外，由于白藜蘆醇是SIRT1的激活劑，其緩解氧化應激，降低卵泡閉鎖的機制可能與其激活SIRT1及其下游通路(FoxO1)有關[17,76]。

槲皮素是一種廣泛存在于水果、蔬菜和樹葉中的天然自由基清除劑，動物(鼠、豬和禽)模型上的研究表明槲皮素可以增加卵巢中抗氧化酶的活性，緩解由重金屬(鎘)造成的卵巢功能降低，降低由氧化應激(H2O2、重金屬鎘、T-2毒素誘導)引發的顆粒細胞凋亡，從而提高卵巢功能[16,77-80]。

此外，其他植物提取物如姜黃素(curcumin)[81-84]、原花青素[85]、辣椒素[82]等也可以緩解氧化應激導致的顆粒細胞的凋亡和卵泡閉鎖，緩解卵巢氧化損傷，但抗氧化劑對卵泡閉鎖的作用目前研究的還不深入，機制有待進一步揭示。

5 小 結

卵泡閉鎖是影響家禽產蛋性能和繁殖性能的重要因素，近年來的研究表明氧化應激是誘導卵泡閉鎖的重要因素之一，而凋亡和自噬均是卵母細胞和顆粒細胞死亡的重要機制。已有的研究表明，氧化應激可以通過線粒體途徑、內質網應激途徑以及死亡受體途徑引起顆粒細胞和卵母細胞的凋亡，也可以通過FoxO1依賴的自噬通路引起顆粒細胞和卵母細胞的死亡；同時，抗氧化物質如茶多酚、白藜蘆醇、槲皮素等還可以緩解氧化應激，降低卵泡閉鎖。因此，深入研究并揭示卵泡閉鎖的關鍵機制，可為通過營養手段調控卵泡的閉鎖，提高家禽的繁殖性能提供理論基礎。