體外誘導豬顆粒細胞黃體化方法的比較研究

呂嘉順，程佳瑞，張瑞門，鄒超霞，安 強，李鵬舉，韋 瑤，鄧彥飛，韋英明

（1.廣西大學動物科學技術學院，亞熱帶生物資源保護利用國家重點實驗室，廣西南寧 530004；2.廣西大學農牧產業發展研究院，廣西南寧 530004）

母豬黃體發育不全作為母豬繁殖障礙的關鍵障礙之一，是亟待解決的重要繁殖障礙。目前，母豬黃體發育不全的病因尚不清楚，可能與黃體發育過程中的顆粒細胞黃體化有關[1-3]。因此需要進一步研究顆粒細胞黃體化的機制，為解決母豬黃體發育不全提供理論基礎。

在體外成功構建一種豬顆粒細胞黃體化模型對研究豬的顆粒細胞黃體化尤為重要。Li 等[4]使用含10%胎牛血清（FBS）的培養基正常培養牛顆粒細胞48 h，牛顆粒細胞發生黃體化，未對其進行驗證；Zhang 等[5]也使用同樣的方法培養山羊顆粒細胞48 h 使其黃體化，并使用了油紅O 和ELISA-P4進行驗證；Bruce[6]提出P450scc和STAR是黃體化的重要標志性基因；Richards等[7]提出顆粒細胞黃體化是一個很快速的過程，在LH峰作用下4 h 內顆粒細胞就發生黃體化；Sugino[8]給小鼠注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）來使小鼠排卵和產生黃體，發現顆粒細胞黃體化后，STAR和CYP19A1表達顯著降低，推測其與DNA 甲基化有關；譚淇蔓[9]、李南燕等[10]在體外使用1.0 IU/mL HCG 誘導24 h 可成功使小鼠顆粒細胞黃體化；Fadhillah 等[11]發現使用2 μg/mL 胰島素（Insulin）誘導24 h 可使牛顆粒細胞黃體化。武秀峰等[12]也發現胰島素可增加人顆粒細胞上LHR 的表達，使顆粒細胞黃體化。

綜上，體外誘導顆粒細胞黃體化的方法有3 種，分別是用10% FBS 培養基培養顆粒細胞的自然培養法、HCG 法和胰島素法，但哪種方法可成功使豬顆粒細胞黃體化未見定論。本研究選擇這3 種方法對豬顆粒細胞進行誘導，并從孕酮（P4）含量、細胞活力和黃體化相關基因表達差異等方面進行比較，為后續開展顆粒細胞黃體化的機理的研究提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 卵泡顆粒細胞的培養 豬卵巢取自魯班路肉聯廠180 日齡左右的健康商品母豬。收集卵泡發育好的卵巢，置于37℃盛有含 2%青鏈霉素的生理鹽水的保溫杯中，于2 h 內帶回實驗室。用37℃無菌生理鹽水沖洗卵巢3～4 次后，用滅菌紗布拭干卵巢表面水分，選取直徑為3～6 mm 的卵泡，用10 mL 注射器配10 號針頭抽取卵泡液（注意避開血管），用提前燒好的撿卵針將上述操作獲得的卵泡液中的卵母細胞挑出，收集已挑出卵母細胞的卵泡液，用細胞篩（40 μm）過濾掉多余雜質，收集液體，低速離心（1 200 r/min）3 min，棄上清，用PBS 重懸清洗2～3 遍，用含10% FBS、2%青鏈霉素的DMEM 重懸細胞，置于37℃，5% CO2環境下培養。

1.2 主要試劑 Trizol 試劑購自Invitrogen 公司，HCG購自寧波第二激素廠，DMEM 高糖基礎液體培養基（GIBCO）、胎牛血清（FBS，GIBCO）、胰酶等均購自Life 公司，1%青霉素/鏈霉素，胰島素均購自北京索萊寶公司，FSHR 抗體購自萬類生物科技公司，豬孕酮ELISA 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，CCK-8 試劑購自諾唯贊生物科技有限公司。BD pharmingen FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit1購自BD 生物科技公司。

1.3 引物設計 應用Oligo 7.0 軟件設計引物，用于熒光定量PCR 實驗，具體信息如表1 所示。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 黃體化處理

1.4.1 自然培養方法 將收集到的顆粒細胞按上述方法在37℃，5%CO2細胞培養箱中培養0～3 d。

1.4.2 HCG法分別添加3、5、10 IU/mL 和20 IU/mL HCG 于豬顆粒細胞培養液中，培養1 d 后，用豬孕酮ELISA 試劑盒檢測孕酮含量，選擇P4含量最高的那一組作為最佳濃度，繼續培養2 d，并檢測每天的孕酮含量，選擇P4含量最高的培養天數作為最佳培養時間。依據最佳濃度和最佳培養時間確定最終處理方法。用QRTPCR 檢測黃體化相關基因CYP11A1、STAR、HSD3B1的表達。

1.4.3 Insulin 法分別添加1、2、4 μg/mL 和8 μg/mL的Insulin 于豬顆粒細胞中，培養1 d 后，用豬孕酮ELISA 試劑盒檢測P4含量，選擇P4含量最高的那一組作為最佳濃度，分別培養1、2、3 d 并檢測每天的P4含量，選擇P4含量最高的培養天數作為最佳培養時間。依據最佳濃度和最佳培養時間確定最終處理方法。用QRTPCR 檢測黃體化相關基因CYP11A1、STAR、HSD3B1的表達。

1.5 細胞形態觀察 采用3 種不同的方法處理細胞后，去除DMEM/F12 培養基，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗去未貼壁細胞后在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態差異并拍照記錄。

1.6 細胞活力測定 將細胞接種至96 孔板中，按3 種方法處理后，按說明書向每孔中加入10 μL CCK-8，繼續培養2 h 后用酶標儀在450 nm 波長下測吸光度，后根據說明書計算其細胞活力。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 胰酶消化細胞后，室溫離心（1 200 r/min）3 min，棄上清，1×PBS 洗滌。每組收集大約1×106個細胞，加入500 μL binding buffer，反復吹打均勻，分別添加5 μL PI 和AnnexinV-FITC，混勻后避光靜置5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.8 實時熒光定量PCR（QRT-PCR）檢測黃體化相關基因STAR、CYP11A1和HSD3B1的表達，采用3 種不同的方法處理細胞后，棄去上清，用Trizol 法提取細胞RNA 后，進一步用反轉錄試劑盒制備cDNA。根據所得cDNA 進行 QRT-PCR，反應體系20 μL：SYBR qPCR MasterMix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，滅菌雙蒸水8.2 μL。反應條件：預變性：60 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min；變 性：95 ℃，15 s，退 火、延伸：60℃，1 min，循環36 個。根據獲得的CT 值用GraphPad Prism 8 軟件進行作圖。所用引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 基因引物合成序列

1.9 免疫熒光法檢測FSHR 的表達 細胞在培養24 h 后，棄掉培養基，用PBS 徹底清洗后，加入4%多聚甲醛，在4 ℃冰箱中固定30 min，用PBS 清洗3 遍（每次10 min）后，加入0.1%Triton-X-100 透化20 min，PBS清洗3 遍（每次10 min），用5%牛血清蛋白（BSA）室溫封閉1 h，用抗FSHR 的抗體4℃孵育過夜。一抗孵育結束后，用PBS 清洗3 遍（每次10 min），室溫孵育羊抗兔二抗1 h，用PBS 清洗3 遍（每次10 min），滴加DAPI 避光孵育5 min，用PBS 洗一遍后，在熒光顯微鏡下觀察染色結果并拍照記錄。

1.10 統計分析 每個實驗重復3 次，統計分析采用SPSS17.0 軟件，所有數值均以平均值± 標準誤表示。兩組間的統計學差異采用T 檢驗，超過兩組的采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05 時記為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 顆粒細胞的鑒定 為驗證收集的細胞是豬顆粒細胞，采用顆粒細胞的特異性抗原FSHR 作免疫熒光來驗證，結果如圖1 所示，FSHR 染色為陽性，表明所收集的細胞是顆粒細胞。

圖1 FSHR 免疫熒光

2.2 黃體化處理結果 自然培養法：在體外環境下，連續培養豬顆粒細胞3 d，每天檢測細胞培養液中P4含量，發現細胞培養液中P4含量持續下降（圖2），說明細胞并未發生黃體化。HCG 法：在體外培養豬顆粒細胞中添加不同濃度的HCG，處理1 d 后檢測細胞培養液中P4含量，結果顯示5 IU/mL HCG 處理的顆粒細胞中分泌的P4含量最高；接著分別使用5 IU/mL HCG 培養顆粒細胞1、2、3 d，結果顯示，處理2 d 組顆粒細胞中分泌的P4含量最高，因此，選擇5 IU/mL HCG 處理2d 的豬顆粒細胞作為黃體化細胞模型用于后續實驗（圖3）。胰島素法：在培養豬顆粒細胞過程中添加不同濃度的Insulin，處理1 d 后檢測細胞培養液P4含量，結果顯示2 μg/mL 胰島素處理的顆粒細胞中分泌的P4含量最高；接著分別使用2 μg/mL 胰島素培養顆粒細胞1、2、3 d，結果顯示，隨著天數增加，顆粒細胞中分泌的P4含量逐漸升高（圖4）。因此，選擇2 μg/mL 胰島素處理3 d 的豬顆粒細胞作為黃體化細胞模型用于后續實驗。

圖2 自然培養法誘導顆粒細胞黃體化后P4 濃度

圖3 HCG 處理顆粒細胞后P4 濃度

圖4 胰島素處理豬顆粒細胞后P4 濃度

2.3 不同方法所獲細胞形態分析 采用自然培養法、HCG 法、胰島素法3 種方法對顆粒細胞進行處理之后，細胞形態飽滿，呈星狀，放射狀，與正常顆粒細胞形態無明顯差異（圖5）。

圖5 3 種方法處理后的顆粒細胞

2.4 細胞活力檢測 如圖6 顯示，培養2 d 后，以正常細胞為對照組進行比較發現，HCG 組的細胞活力降低（P＜0.05），胰島素組沒有顯著差異。

圖6 Insulin 法與HCG 法對顆粒細胞活力的影響

2.5 黃體化相關基因的表達檢測 如圖7 所示，與對照組相比，HCG 組顆粒細胞中STAR顯著上升（P＜0.05），3β-HSD下降（P＜0.05），CYP11A1沒有顯著差異；胰島素誘導3 d 后的豬顆粒細胞中，3β-HSD和STAR下降（P＜0.05），CYP11A1上升（P＜0.05）。

圖7 QRT-PCR 技術檢測2 種方法處理顆粒細胞后的黃體化基因的相對表達量

2.6 流式凋亡檢測 如圖8 所示，與對照組相比，5 IU/mL HCG 組凋亡率增加（P＜0.05），2 μg/mL Insulin 組凋亡率降低（P＜0.05）。

圖8 流式細胞檢測顆粒細胞凋亡率

3 討 論

McRae 等[13]率先提出顆粒細胞黃體化的機制可能與顆粒細胞與卵母細胞之間的物質交換和信息交流有關，指出顆粒細胞分泌孕激素能力的增強和分泌雌激素能力的下降可被視為黃體化的標志，并將STAR、CYP11A1和3β-HSD視為黃體化的標志基因。Sugino[8]進一步研究發現顆粒細胞中STAR表達量顯著上升和CYP19A1表達量顯著下降也可作為黃體化的標志之一，并通過RNA-seq 技術預測了表觀修飾在顆粒細胞黃體化過程中也具有重要作用。本實驗使用含有10% FBS的培養基培養豬顆粒細胞3 d，發現其分泌的P4含量持續下降，認為豬顆粒細胞并未發生黃體化。而Zhang等[5]實驗結果表明采取10% FBS 的培養基培養山羊顆粒細胞可使其分泌孕激素的能力顯著增強，這與本實驗結果相悖，可能是由于物種特異性等原因。本實驗中，使用5 IU/mL HCG 誘導2 d 也可使豬顆粒細胞分泌大量P4，P4含量可達50～60 ng/mL，并且黃體化相關基因STAR、CYP11A1顯著升高，3β-HSD顯著降低，認為顆粒細胞也發生黃體化。與使用2 μg/mL 胰島素誘導3 d后的豬顆粒細胞而言，后者的P4含量達到了300 ng/mL，胰島素法處理后的豬顆粒細胞其細胞活力更高，凋亡率更低，更適合作為合適的細胞模型開展后續實驗。本實驗中，2 種方法處理后的豬顆粒細胞的STAR基因相對表達量變化趨勢不一致，這與Fadhillah 等[11]使用胰島素誘導牛顆粒細胞黃體化結果有些許差異，可能是由于物種特異性所致。查閱NCBI 上的豬的STAR基因的表達圖譜可知，STAR在豬顆粒細胞上的表達本身就很低，不宜用作豬顆粒細胞黃體化的參考標志之一[14]。具體原因還有待后續實驗的進一步研究。

本實驗僅比較了3 種體外誘導顆粒細胞黃體化的方法，對于其他體外誘導顆粒細胞黃體化方法未進行比較，得到的結論具有一定的局限性。同時，對于顆粒細胞黃體化的驗證標準還略顯單薄，今后的研究可以利用轉錄組學等新興技術篩選出更多顆粒細胞黃體化標志物，進一步豐富顆粒細胞黃體化的驗證方法，深入研究顆粒細胞黃體化的機制，為解決母豬黃體發育不全提供理論基礎[15]。

4 結 論

本次實驗成功構建了體外誘導豬顆粒細胞黃體化的模型，彌補了體外誘導豬顆粒細胞黃體化的空白，利用ELISA、QRT-PCR 進行了黃體化驗證，符合目前對于顆粒細胞黃體化的驗證標準。實驗利用CCK-8 和流式細胞術檢測了細胞活力和細胞凋亡，最終確定了使用2 μg/mL 胰島素誘導3 d 作為體外誘導豬顆粒細胞黃體化的最適方法。