愛玉子上幼期愛玉子榕小蜂與蟲癭的協同發育

吳婷婷, 吳文珊, 陳友鈴,*, 黃 鎮, 周蓮香

(1. 福建師范大學生命科學學院, 福建省發育與神經生物學重點實驗室, 福州 350117;2. 臺灣大學生態學與演化生物學研究所, 臺北 10617)

愛玉子Ficuspumila.var.awkeotsang雌雄異株，隸屬于?？?Moraceae)榕屬Ficus，分布于我國臺灣、福建、浙江，分布在海拔800-1 800 m的山地(中國植物志編輯委員會, 1998)。20世紀80年代，經過野生馴化實現了愛玉子立地栽培，現已成為我國南方特有果樹，其瘦果含有大量的果膠和果膠酶，可以制成風味獨特、清涼消暑的冷飲(林贊標等, 1990; 賴柏全, 2010)。愛玉子榕小蜂Wiebesiasp. nr.pumilae(薜荔榕小蜂Wiebesiapumilae的相近種)屬膜翅目(Hymenoptera)榕小蜂科(Agaonida)，是愛玉子的專性傳粉榕小蜂(江少華, 2011; 吳文珊等, 2013a)，沒有榕小蜂傳粉愛玉子無法結實，沒有愛玉子提供癭花為產卵場所，榕小蜂就無法繁殖后代，榕小蜂與榕樹間維持著長期穩定的互利共生關系(林贊標等, 1990; 吳文珊和陳友鈴, 2008; 賴柏全, 2010)。榕小蜂幼蟲在蟲癭中發育階段漫長，與榕樹互動最為親密(Jansen-González and Sarmiento, 2008; Jansen-Gonzálezetal., 2012, 2014; Yangetal., 2012; Jiaetal., 2014; Yadav and Borges, 2018)，但由于榕小蜂個體小，生活隱蔽，對其幼期發育研究幾乎空白。為了解愛玉子榕小蜂與蟲癭之間的互作機制，本研究將探討：(1)愛玉子榕小蜂與蟲癭協同發育的動態變化；(2)愛玉子榕小蜂在蟲癭內的營養來源及位置變化；(3)愛玉子榕小蜂體長與蟲癭大小的發育相關性；(4)冬、夏季愛玉子榕小蜂發育歷期的差異。開辟昆蟲-植物互作研究的新視角，為進一步揭示榕樹-榕小蜂協同進化的內在機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

已被產卵的愛玉子雄果采集于福建省泉州市愛玉子種植園，雌、雄株一年均有2次花期。夏季樣品采集始于2018年4月10日，選定6棵愛玉子雄株，密切關注榕果發育狀態，4月20日對A期未進蜂的榕果進行套袋，防止小蜂和其他昆蟲進入榕果內。2018年5月10日通過放蜂獲得80個同期被產過卵的進蜂榕果，此后每隔3～4 d采集3個進蜂榕果帶回實驗室備用，采樣每周兩次，直至2018年8月20日小蜂全部出飛結束。冬季樣品采集時間為2018年8月1日至2019年5月30日，8月15日通過套袋放蜂獲得150個同期進蜂果。

1.2 蟲癭和傳粉榕小蜂發育的觀察和測量

縱向切開榕果，觀察蟲癭發育狀況，從單個榕果中隨機挑取30個蟲癭，在體視顯微鏡下(Nikon SMZ1500)用游標卡尺測量蟲癭的長徑和短徑(圖1)，然后用解剖針對蟲癭進行逐層解剖。使用生物顯微鏡(Olympus BX51)觀察蟲癭結構、愛玉子榕小蜂發育狀態及其在蟲癭內的位置，運用景深擴展軟件(Image-Pro Plus)和成像系統(SteREO Lumar V12)進行拍照和測量。記錄蟲癭上小蜂交配孔和出飛孔的位置。榕小蜂發育歷期計算：參考王芳等(2016)的統計方法，以放蜂時間為小蜂發育起點，記錄小蜂的發育階段和日齡，根據日齡表得出各階段的發育歷期。記錄實驗期間樣地每月的平均氣溫和平均降水量。

圖1 蟲癭形態結構示意圖

1.3 蟲癭殼和瘦果果殼的形態結構比較

選取幼蟲期各階段的蟲癭和成熟的瘦果樣品進行固定，固定方法參見Jia等(2014)，再經臨界點干燥后取出，用銅導電膠帶粘于樣品臺上，用離子濺射儀鍍膜，放入掃描電子顯微鏡的樣品箱進行觀察。

1.4 數據分析

用SPSS17.0和EXCEL2003軟件對數據進行統計學分析和作圖。

2 結果

2.1 幼期愛玉子榕小蜂與蟲癭協同發育過程

愛玉子榕小蜂的產卵針插入癭花花柱，產卵于花柱基部子房內珠被與珠心間隙中(圖2: A)，癭花花柱被產卵后枯萎(圖2: B)。在產卵后的1-3 d(孵化期)，珠心組織的細胞迅速膨大，細胞液劇增，使原本緊實的珠心組織快速轉化為營養薄壁組織。子房不對稱膨大，導致花柱位置下移至側方，扁圓形的子房轉變為長橢球形蟲癭(圖2: B)，同時，蟲癭柄也快速伸長。

愛玉子榕小蜂發育分為卵期、幼蟲期和蛹期，幼蟲分為5齡(蟲齡劃分另文發表)，無法分辨雌雄，幼蟲蟲體呈圓柱形，頭端大，尾端小，體表光滑，軀體柔軟，具13體節；1齡(圖2: C)、2齡(圖2: D)幼蟲蟲體直，3齡(圖2: E)、4齡(圖2: F)、5齡(圖2: G)幼蟲蟲體彎曲呈“C”型；1-3齡幼蟲蟲體白色半透明(圖2: C, D, E)，可看到中腸充滿了白色或黃色顆粒，4、5齡幼蟲的體壁肌肉組織發達，呈不透明的白色(圖2: F, G)。小蜂幼蟲停止取食后，排的蛹便，進入預蛹階段(圖2: H)。蛹期分為3個階段：初期蛹(圖2: I, J)、中期蛹(圖2: K, L)和成熟蛹(圖2: M, N)，雌雄蛹異形分化，復眼最早呈現色彩，且雄蛹發育早于雌蛹1.34±0.27 d (n=236)。

圖2 幼期愛玉子榕小蜂和蟲癭的發育過程

幼蟲期小蜂營養由珠心分化而來的營養層供給。在小蜂1-3齡幼蟲期，營養層的細胞壁薄，細胞液含水量高(解剖蟲癭時，由于薄壁細胞被擠壓或切割造成細胞液外流，故通常觀察到幼蟲位于透明的營養層組織液中)。4齡幼蟲期蟲體與白色半透明粘膠狀營養層的顏色和狀態十分相似(圖2: F)，進入5齡幼蟲期后營養層越發粘稠，呈半固態啫喱狀(圖2: G)。電子顯微鏡下，可見營養層表面存在球狀分泌顆粒，其直徑在小蜂1-3齡幼蟲期約10～50 μm(圖3: A)，在小蜂4-5齡幼蟲期約5-10 μm，且分泌顆粒在泌出后再次堆疊在一起(圖3: B)，推測可能是由于發育初期營養層的細胞液含水量高，易分泌，故分泌顆粒較大。由此推斷，榕小蜂幼蟲發育以營養層的分泌物為食。營養層在小蜂發育至5齡幼蟲末期(預蛹期)時消失(圖2: H)，蛹期的小蜂不再攝取食物。

圖3 蟲癭和瘦果結構比較

蟲癭殼(圖3: C)由表皮層、保護層和內皮層組成(圖3: D)，蟲癭表皮層由子房壁外層分化而來，幼蟲期白色透明，蛹期始顏色逐漸變黃，小蜂羽化時呈褐色。蟲癭內皮層由珠被分化而來，隨著卵的孵化，珠心膨大，內皮層變薄并緊貼于保護層。表皮層和內皮層均膠質化，富含水分，為小蜂提供良好的濕度保障。蟲癭保護層由子房壁內層分化而來，由長管狀厚壁細胞(圖3: E, F)組成，細胞從蟲癭柄端向遠柄端延伸，并在匯合處發生折疊(圖3: G)，因此，兩端保護層較厚，中部保護層較薄(圖3: C)。在小蜂1-2齡幼蟲期，蟲癭保護層厚壁化程度低，蟲癭殼透明(圖2: C, D)，保護層各個部位的厚度較一致(圖3: H)；進入3齡幼蟲期，保護層細胞厚壁化明顯，癭殼透明度降低(圖2: E)，3齡幼蟲末期蟲癭體積已接近最大值；4齡幼蟲期后蟲癭殼呈不透明的米白色。保護層是癭殼的骨架，主要起保護作用，為小蜂提供相對獨立和安全的生存空間，并對非傳粉榕小蜂有一定的防御作用。

在電子顯微鏡下對蟲癭殼(圖3: C)和瘦果果殼(圖3: I)的形態結構進行比較，結果表明：(1)二者雖然均為長橢圓形，但蟲癭較為渾圓，而瘦果細長；蟲癭長(3.21±0.23 mm,n=30)和寬(1.55±0.06 mm,n=30)均顯著大于瘦果的長(2.34±0.09 mm,n=30)和寬(0.89±0.11 mm，n=30)；蟲癭長寬比為2.07∶1，瘦果長寬比為2.62∶1，兩者存在顯著差異(P<0.05)。(2)與瘦果果殼(圖3: I)比較，蟲癭殼(圖3: C)保護層的厚度顯著增厚，尤其在端部約增厚2倍(P<0.05)。(3)營養層功能差異，只有蟲癭營養層具備向榕小蜂幼蟲輸送營養液的作用。綜上可見愛玉子榕小蜂的造癭作用，既改變了殼的形態，又改變了營養輸送功能。

2.2 幼期愛玉子榕小蜂在蟲癭內的位置變化

愛玉子榕小蜂1、2齡幼蟲位于花柱基部(圖2: C, D)，3齡幼蟲遷移至蟲癭上側(圖2: E)，隨著小蜂發育，愈來愈大的蟲體由上側向下擴展(圖2: F, G)。1-4齡幼蟲能蠕動和翻轉，故蟲體的頭尾和背腹方向隨機，但5齡前中期幼蟲“C”型蟲體的頭尾在下(圖2: G)，而末期5齡幼蟲會發生“翻轉”，故預蛹頭尾在上，且占滿整個蟲癭(圖2: H)。蛹期中雌蛹的體位均“頭尾在上”(100%,n=235)(圖2: I, K, M)，而雄性蛹的體位多為“頭尾在上”(圖2: J, L, N)，少數“頭尾在下”(1.67%,n=120)。

統計結果表明，97%的雌、雄愛玉子榕小蜂的出飛孔和81%的雄峰所打的交配在圖中所示位置(圖2: M, N，紅框所示位置)，蟲癭保護層在該位置較薄，便于鉆孔，也表明蟲癭內部空間狹小，小蜂活動范圍有限，小蜂在化蛹時就已確定好體位，便于羽化出飛。

2.3 愛玉子榕小蜂體長與蟲癭直徑的發育動態

愛玉子榕小蜂幼蟲在1-4齡期生長速度較快，增長率為25.91 μm/d；5齡期生長較緩慢，增長率為6.26 μm/d；5齡末期幼蟲體長增長進入平臺期；蛹期小蜂體長略有增加，但增幅不大(圖4)。在1-3 齡幼蟲期蟲癭快速膨大(1齡幼蟲期增幅尤其明顯)，在小蜂發育至4齡時，蟲癭直徑增長進入平臺期，即蟲癭發育進入平臺期的時間早于小蜂，為小蜂發育提供充足的生長空間。由于蟲癭長徑增長較快(長徑增長率為短徑的1.80倍，長徑增長率為26.43 μm/d，短徑增長率為14.67 μm/d，卵期的蟲癭為扁球形，隨小蜂發育至4齡初期，蟲癭變為長橢球形；蟲癭在小蜂羽化期可能由于蟲癭殼脫水，以及小蜂活動，導致長徑稍縮短，而短徑稍增長(圖4)。

圖4 愛玉子榕小蜂體長與愛玉子上蟲癭直徑的發育動態

2.4 夏季和冬季愛玉子榕小蜂發育歷期比較

在福建地區愛玉子榕小蜂一年2代，世代歷期明顯不同，夏季世代歷期(5月中旬-8月中旬)約112 d，幼蟲期約80 d；冬季世代歷期(8月中旬-翌年5月中旬)約253 d，幼蟲期約192 d。冬季各階段幼蟲的發育歷期均比夏季長，尤其是5齡幼蟲的發育歷期，冬季(91 d)比夏季(25 d)延長了66 d，小蜂以5齡幼蟲越冬，延長進食期有利越冬。從圖5可知，在氣溫高、水分充足的夏季，愛玉子榕小蜂發育歷期較短；而在氣溫較低、水分較少的秋冬季，愛玉子榕小蜂發育歷期較長。

圖5 兩代愛玉子榕小蜂發育歷期及水熱條件比較

3 討論

3.1 榕小蜂幼蟲的攝食方式

關于榕小蜂幼蟲在榕果蟲癭內的攝食方式，目前沒有直接的實驗研究結果，均是通過對幼蟲期榕小蜂蟲癭顯微解剖(Leclerc du Sablon, 1908; 姚若潔, 1998; Jiaetal., 2014)和組織切片的觀察結果(Jansen-Gonzálezetal., 2012, 2014)推測榕小蜂幼蟲依賴植物胚珠和胚乳組織存活，認為榕小蜂孵化后進入珠心組織中，直接攝食植物組織。但本研究根據對蟲癭結構的電鏡觀察可知，蟲癭營養層向愛玉子榕小蜂生存的空間分泌球狀顆粒，愛玉子榕小蜂位于分泌液中；運用4%多聚甲醛對蟲癭進行固定，其結果也證明愛玉子榕小蜂幼蟲與營養層(即早期為珠心組織)一直都處于分離狀態。因此，我們推測：(1)榕小蜂孵化后并沒有進入珠心組織中，而是依然位于珠心與珠被之間，避免傷害胚珠，讓被產卵的癭花子房仍能完成初期的發育(Verkerke, 1989)，同時也避免導致寄主植物產生抗性反應(嚴盈, 2008)。(2)建群蜂在產卵時將多肽、蛋白質和其他化合物混合組成的產卵分泌物注入寄主植物的組織中(Moreau and Guillot, 2005; Asgari and Rivers, 2011)，導致珠心組織的細胞迅速膨大，細胞液劇增，使原本緊實的珠心組織快速轉化為柔軟營養薄壁組織，為幼蟲提供活動空間，蟲癭切片顯示孵化后的榕小蜂位于珠心組織中(Jansen-González, 2012)，可能僅僅是幼蟲與珠心組織相對位置疊加產生的現象。(3)榕小蜂幼蟲并不是直接取食植物組織，而是吸食通過建群蜂產卵分泌物(Moreau and Guillot, 2005; Asgari and Rivers, 2011)和幼蟲攝食分泌物(Miles, 1999; 嚴盈等, 2008; 郭瑞等, 2012)刺激植物組織分泌的營養液。

有人認為榕小蜂幼蟲從花柱基部遷移至蟲癭上側(遠柄端胚乳所在位置)，與小蜂取食胚乳有關(Leclerc du Sablon, 1908; Verkerke, 1989; 姚若潔, 1998; Jansen-Gonzálezetal, 2008, 2012; Jiaetal., 2014)，但不以胚乳為食的重寄生肉食性非傳粉榕小蜂的幼蟲在3齡期也一樣移動至遠柄端(Galiletal., 1970; Eliasetal., 2012; Jansen-Gonzálezetal., 2014)，因此，我們推測小蜂幼蟲在蟲癭內的位置變化并非由于幼蟲攝食胚乳所致，而是因為榕果的胚珠為斜掛式胚珠，胚囊位于遠柄端(Verkerke, 1989)，此處空隙較大，小蜂幼蟲選擇進入結構松散的區域，便于蟲體活動。

3.2 影響榕小蜂發育歷期的因素

榕小蜂寄生于榕果中，因此寄主榕果發育期是影響小蜂發育歷期的首要因素。不同種類的榕樹，榕果發育周期明顯不同，如愛玉子榕果的發育周期長，一年結實2次，榕果的發育歷期3～10月，榕小蜂的發育期與寄主榕果的發育期同步，歷期亦長(吳文珊和陳友鈴, 2008)；細葉榕Ficusmicrocarpa榕果的發育周期短，單株一年結實1～4次，榕果發育歷期較短，其榕小蜂的發育期亦短(吳文珊等, 2013b)。在西雙版納，木瓜榕Ficusauriculata間花期約70 d，海南榕Ficushainanensis間花期約40 d，Yang等(2012)交換了木瓜榕和海南榕的傳粉榕小蜂之后，發現在木瓜榕中發育的海南榕傳粉榕小蜂Ceratosolensp.發育歷期增長，而在海南榕榕果中發育的木瓜榕傳粉榕小蜂Ceratosolenemarginatusy發育歷期縮短，表明寄主榕樹的繁殖特性決定小蜂發育歷期。

其次，繁殖地的水熱條件影響榕果發育歷期，從而影響小蜂發育歷期。即同一地區的同種榕樹在一年中不同的季節榕果發育期不同，小蜂發育歷期亦不同。例如，愛玉子榕果的發育期在水熱條件較好的夏季為3～4個月，而在秋冬季為8～10個月，其傳粉榕小蜂的發育歷期與果同步，本實驗結果表明，冬季愛玉子榕小蜂發育的各階段歷期均比夏季的長，尤其是5齡幼蟲期明顯延長，即延長了攝食期以應越冬(圖5)。

榕小蜂發育歷期還與食物源相關，寄主相同的造癭蜂、重寄生蜂和寄居蜂，產卵時間不同(通常造癭蜂先產卵，重寄生蜂和寄居蜂后產卵)但出飛時間相近(Cruaudetal., 2013; Yadav and Borges, 2018)，表明植食性造癭蜂的發育歷期較長，而肉食性和植食性兼具的重寄生蜂和寄居蜂發育歷期較短，推測同源性食物有利于小蜂對營養成分的吸收。