DPP-4抑制劑通過Nrf2/HO-1/P21信號通路抑制肺動脈平滑肌細胞增殖的分子機制研究

柯 蕊,和 平,張永紅,張 偉,劉 原

(西安交通大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:liuyuan@mail.xjtu.edu.cn)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension)是一類常見的肺血管疾病,表現為靜息狀態下肺動脈壓力升高,同時合并不同程度右心功能衰竭。肺動脈高壓在全球發病率為1%,在老齡化超過65歲的人群中可達到10%,嚴重危害著全球人類健康[1]。目前臨床上治療肺動脈高壓的靶向藥物副作用多、治療費用昂貴,導致肺動脈高壓治療的依從性大大降低,給肺動脈高壓的治療帶來新的挑戰。

二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4, DPP-4)抑制劑主要通過促進胰島素分泌,增高葡萄糖耐量,降低胰島素抵抗,被用于2型糖尿病的治療。最近的研究表明,DPP-4抑制劑還具有心血管保護作用,如改善血管內皮功能、降低血管平滑肌細胞增殖、抑制心肌細胞凋亡、減輕血管炎癥反應等[2]。進一步研究提示DPP-4抑制劑的心血管保護作用與激活核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor-2, Nrf2)/血紅素加氧酶1(hemeoxygenase-1, HO-1)信號通路有關[3-5]。在肺動脈高壓的研究中也發現,DPP-4抑制劑可抑制肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)增殖,降低動物模型的肺動脈壓力并逆轉肺血管重塑,提示DPP-4抑制劑可能成為肺動脈高壓治療的潛在藥物[6,7]。然而,DPP-4抑制劑是否通過Nrf2/HO-1通路發揮抑制PASMCs增殖的作用,目前尚未見報道。本研究通過5-HT刺激原代PASMCs增殖,探討DPP-4抑制劑是否抑制5-HT誘導的PASMCs增殖,并探討其中的分子機制,以期為防治肺血管重塑及肺動脈高壓的策略提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供;DMEM高糖培養基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;ML385、SnPP購自美國Sigma公司;西格列汀購自默沙東制藥有限公司;BrdU細胞增殖檢測試劑盒購自中國上海麥約爾生物技術有限公司;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;大鼠P21 siRNA購自中國上海吉瑪制藥技術有限公司;兔抗大鼠α-SM-actin單克隆抗購自英國Abcam公司;FITC標記的山羊抗兔IgG購自中國中杉金橋生物技術公司;兔抗大鼠Nrf2、HO-1、P21單克隆抗體購自美國CST公司;兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體、HRP標記抗兔二抗購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠PASMCs的培養及鑒定 4周齡SD大鼠,體質量70-80 g,腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,取出大鼠心臟和肺臟組織,在無菌條件下分離出肺動脈,鈍性刮去內、外膜,將剩余血管中膜剪切成約1 mm×1 mm大小組織塊,均勻擺置于細胞培養瓶底,加20% FBS-DMEM培養基,于37 ℃、5% CO2培養,待大部分組織塊長出細胞暈,并與相鄰組織塊的細胞暈呈亞融合狀態時可進行傳代。應用抗α-SM-actin免疫熒光染色鑒定其純度,確保血管平滑肌細胞純度≥90%。取第3-6代PASMCs接種于含10% FBS-DMEM培養基,置于37 ℃,5% CO2培養箱中培養。

1.2.2 BrdU摻入法檢測細胞增殖 5-HT是一種重要的促細胞有絲分裂原。我們前期研究已發現1 μmol/L 5-HT可明顯刺激PASMC增殖[8]。為明確西格列汀對PASMCs增殖的影響,將PASMCs分為對照組、5-HT組、不同濃度西格列汀(2.5,5,10,20,40 μmol/L)+5-HT組。對照組不進行任何處理,5-HT組加入1 μmol/L 5-HT刺激24 h,不同濃度西格列汀+5-HT組在加入5-HT前分別用2.5,5,10,20,40 μmol/L西格列汀預處理30 min,應用BrdU試劑盒檢測各組細胞增殖情況并篩選西格列汀作用濃度。為研究西格列汀是否通過Nrf2/HO-1/P21信號通路抑制PASMCs的增殖,將PASMCs分為對照組、5-HT組、西格列汀+5-HT組,Nrf2抑制劑ML385+西格列汀+5-HT組,HO-1抑制劑SnPP+西格列汀+5-HT組,P21 siRNA轉染+西格列汀+5-HT組。對照組、5-HT組、西格列汀+5-HT組處理同前,ML385+西格列汀+5-HT組及SnPP+西格列汀+5-HT組在加入1 μmol/L 5-HT前用西格列汀分別聯合5 μmol/L ML385或10 μmol/L SnPP預處理30 min,P21 siRNA轉染+西格列汀+5-HT組預先轉染P21 siRNA 24 h后聯合西格列汀,再加入1 μmol/L 5-HT作用24 h后,采用BrdU摻入法檢測各組細胞增殖情況。以上每組設6個復孔。終止細胞培養前8 h加入BrdU繼續培養,隨后固定細胞、變性DNA、清洗細胞,加入BrdU抗體培養細胞,再次清洗細胞后加入辣根過氧化物酶標記的二抗培養,清洗細胞后加入TMB底物顯色,加入反應終止液后用分光光度計測量細胞的吸光度,吸光度的強弱與插入細胞DNA中的BrdU量成正比,從而反映出DNA合成(細胞增殖程度)。

1.2.3 細胞轉染 采用Lipofectamin 2000試劑盒轉染P21 siRNA。待細胞至60%融合,用不含血清的DMEM培養液分別稀釋P21 siRNA和Lipofectamin試劑,混合后室溫培養20 min后加入細胞,繼續培養48 h,提取細胞總蛋白,應用Western blot檢測p21基因沉默效果,以上實驗重復3次。

1.2.4 Western blot檢測細胞Nrf2、HO-1及P21的蛋白水平 為研究在PASMCs中西格列汀是否上調Nrf2及HO-1的蛋白表達,PASMCs給予20 μmol/L西格列汀刺激24 h,應用Western blot檢測細胞中Nrf2及HO-1的蛋白水平。為研究在PASMCs中西格列汀是否通過Nrf2/HO-1上調P21,PASMCs分為對照組、5-HT組、西格列汀+5-HT組、ML385+西格列汀+5-HT組及SnPP+西格列汀+5-HT組處理同前,應用Western blot檢測各組細胞中P21蛋白水平。細胞收集并使用裂解緩沖液提取細胞總蛋白,采用BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白定量后95 ℃煮沸10 min變性制樣,取等量蛋白上樣。運用SDS-PAGE聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳進行蛋白分離,濃縮膠中電壓80 V,分離膠中電壓120 V,直至溴酚藍接近分離膠的底端停止電泳。含20%的甲醇轉印液轉印置(100 V,2 h)至PVDF膜上。緩沖液TBST涮洗,5%脫脂牛奶或5% BSA室溫下封閉2 h,緩沖液TBST洗膜5 min×3次,加入稀釋后Nrf2、HO-1或P21一抗(1 ∶500稀釋),4 ℃孵育過夜。緩沖液TBST洗膜5 min×3次,辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠、山羊抗兔二抗(1 ∶2 000稀釋),室溫下孵育2 h,緩沖液TBST洗膜5 min×3次,ECL顯色,采用Bio-rad成像系統檢測條帶,采集圖像,采用Quantity One軟件進行定量分析,以GAPDH為內參,計算目的蛋白相對表達量,以上實驗重復3次。

1.3 統計分析

采用SPSS13.0統計軟件,多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩組間比較用Tukey post hoc檢驗,重復測量數據行重復測量方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PASMCs的培養及鑒定

PASMCs呈多邊形或梭形,部分融合時,可見典型的“峰-谷”樣生長(見圖1A)。應用抗α-SM-actin免疫熒光染色后,高倍鏡下可見胞漿內大量與細胞長軸平行排列的綠色纖維細絲,鑒定為PASMCs(見圖1B),其純度>90%。

A.“峰-谷”樣生長 (×100) B.細胞免疫熒光染色 (×100)圖1 原代大鼠PASMCs的培養及鑒定Figure 1 Primary culture and identification of rat PASMCs

2.2 DPP-4抑制劑西格列汀可抑制5-HT誘導的PASMCs增殖

5-HT可明顯促進PASMC增殖與對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05,見圖2),而預先給予西格列汀干預,PASMCs的增殖被不同程度逆轉。西格列汀濃度為20 μmol/L時可明顯抑制PASMC的增殖,細胞增殖率下降至對照組的1.35倍,與5-HT組相比,差異有統計學意義(P<0.05,見圖2)。因此,我們在后續的實驗中選擇20 μmol/L西格列汀用于后續實驗。

與對照組相比,*P<0.05;與5-HT組相比,#P<0.05圖2 西格列汀對5-HT誘導PASMCs增殖的影響Figure 2 The effect of sitagliptin on 5-HT-induced PASMC proliferation

2.3 DPP-4抑制劑西格列汀可上調Nrf2及HO-1

20 μmol/L西格列汀作用24 h,Nrf2以及HO-1的蛋白表達量明顯升高,與對照組相比分別增加2.06倍和1.99倍(P<0.05,見圖3)。

與對照組相比,*P<0.05圖3 西格列汀對Nrf2及HO-1蛋白表達的影響Figure 3 The effect of sitagliptin on the protein expression of Nrf2 and HO-1 in PASMCs

2.4 DPP-4抑制劑西格列汀通過Nrf2/HO-1上調P21

與對照組相比,5-HT組中P21蛋白表達量明顯降低(P<0.05);西格列汀+5HT組中P21蛋白表達量高于5-HT組(P<0.05);ML385+西格列汀+5-HT組及SnPP+西格列汀+5-HT組中P21蛋白表達量均低于西格列汀+5HT組(均P<0.05,見圖4)。

與對照組相比,*P<0.05;與5-HT組相比,△P<0.05;與西格列汀+5-HT組相比,#P<0.05圖4 西格列汀可通過Nrf2/HO-1上調P21表達Figure 4 Sitagliptin upregulated P21 expression by Nrf2/HO-1 in PASMCs

2.5 DPP-4抑制劑西格列汀通過Nrf2/HO-1上調P21抑制PASMCs增殖

與對照組相比,5-HT組PASMCs增殖率明顯升高(P<0.05);西格列汀+5HT組PASMCs增殖率低于5-HT組(P<0.05);ML385+西格列汀+5-HT組、SnPP+西格列汀+5-HT組及P21 siRNA+西格列汀+5-HT組PASMCs增殖率均高于西格列汀+5HT組(P<0.05,見圖5)。

3 討論

本研究發現,DPP-4抑制劑西格列汀可明顯抑制5-HT誘導的PASMCs增殖,并上調Nrf2及HO-1的蛋白表達。進一步研究發現,DPP-4抑制劑西格列汀可逆轉5-HT誘導的P21下調,而預先抑制Nrf2或HO-1可部分阻斷西格列汀對P21表達的調控。最后,預先采用Nrf2或HO-1特異性抑制劑或P21 siRNA轉染可逆轉西格列汀對PASMCs增殖的抑制作用。以上研究結果提示,DPP-4抑制劑西格列汀可通過激活Nrf2/HO-1信號通路,上調細胞周期抑制蛋白P21,進而抑制PASMCs增殖。本研究證實了DPP-4抑制劑對PASMCs增殖的抑制作用以及潛在機制,為研發新的靶向治療藥物提供了思路。

與對照組相比,*P<0.05;與5-HT組相比,△P<0.05;與西格列汀+5-HT組相比,#P<0.05圖5 西格列汀通過Nrf2/HO-1上調P21,從而抑制PASMCs增殖Figure 5 Sitagliptin inhibited PASMC proliferation through Nrf2/HO-1-mediated P21 upregulation

Nrf2是機體內一個關鍵的核轉錄因子,參與多種細胞內防御機制相關的信號傳導。研究發現,HO-1是Nrf2主要的下游靶分子之一[9,10]。在正常狀態下,Nrf2與Nrf2的細胞質抑制劑Keap1結合,并被泛素-蛋白酶體途徑降解;在受到外界刺激時,Nrf2從復合體中解離出來,并從細胞質轉移到細胞核,與HO-1啟動子抗氧化反應元件(antioxidant response element, ARE)結合,激活HO-1基因表達,從而發揮細胞保護作用[9,10]。Nrf2/HO-1作為一條經典的抗氧化通路,除在調控抗氧化酶系的表達過程中發揮重要作用外,還具有抗炎、擴血管、改善組織微循環、抑制細胞增殖等多種生物學功能[9-11]。研究發現,DPP-4抑制劑可明顯上調Nrf2的表達,并激活Nrf2,促進其下游基因HO-1及NQO1的表達,從而抑制血管平滑肌的增殖以及血管重塑的發生[3-5]。本研究也發現,DPP-4抑制劑西格列汀可明顯上調Nrf2以及HO-1的表達,并抑制PASMCs的增殖;而預先抑制Nrf2或HO-1可抵消西格列汀對PASMCs增殖的抑制作用,提示DPP-4抑制劑西格列汀通過Nrf2/HO-1信號通路抑制PASMCs的增殖。

P21是負性細胞周期調節蛋白家族的重要成員之一,通過抑制cyclin D1-CDK4/CDK6復合物以及cyclin E-CDK2復合物的激酶活性,從而阻礙細胞從G1期進入S期,負向調控細胞周期的進行。研究發現在多種惡性腫瘤細胞中P21表達的降低,且與腫瘤的預后呈正相關[12]。上調P21的水平可抑制細胞周期的進展和細胞的增殖。研究發現,p21是HO-1的下游重要靶點之一,HO-1可通過上調P21的表達水平抑制哺乳動物細胞增殖[13,14]。本研究發現,細胞有絲分裂原5-HT可明顯下調P21的表達并促進PASMCs的增殖;DPP-4抑制劑西格列汀可逆轉5-HT誘導的P21下調以及PASMCs增殖,而預先抑制Nrf2或HO-1可抵消西格列汀對P21的上調以及對PASMCs增殖抑制作用。以上結果提示DPP-4抑制劑通過激活Nrf2/HO-1信號通路上調P21的表達,從而促進PASMCs的增殖。

肺動脈高壓是一種常見的臨床綜合征,目前的治療藥物雖在一定程度上降低了患者的肺動脈阻力和壓力,但這些藥物常伴有較明顯的不良反應,且治療費用極為昂貴。DPP-4抑制劑是一種口服降糖藥,因其安全、穩定的降糖效果及對心血管系統保護作用而受到內分泌專家的青睞。近年來的研究表明,DPP-4抑制劑除具有降血糖作用外,還可以降低多種腫瘤的發病率以及逆轉血管增殖性疾病的血管重塑[2,15]。本研究發現DPP-4抑制劑西格列汀可抑制PASMCs的增殖,提示DPP-4抑制劑可能成為治療肺動脈高壓的潛在藥物。但目前DPP-4抑制劑在肺動脈高壓中的治療作用仍處于臨床前研究階段,DPP-4抑制劑治療肺動脈高壓的有效性、安全性及最佳治療劑量等問題仍需進一步的試驗來驗證。