熱量限制對老齡小鼠肝臟鐵死亡的抑制作用

張晉毓,田首元,郭志佳

(山西醫科大學第一臨床醫學院麻醉科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:chinatsyjj@126.com)

在衰老的諸多機制中,鐵死亡是最近研究的一個熱點。鐵死亡是鐵依賴性的新型細胞死亡形式,其實質是鐵離子催化作用下代謝發生異常,導致細胞內氧化還原失衡,誘導細胞死亡[1]。熱量限制(caloric restriction,CR)是在保證機體功能的前提下,限制每日總熱量攝入的一種措施,被證明能減少氧化應激的發生,延緩老齡相關疾病的發生發展[2]。SIRT1是熱量限制作用中的一個關鍵蛋白,通過抑制SIRT1可以影響熱量限制的作用效果[3, 4]。目前,國內外尚無鐵死亡和熱量限制關系的相關報道,本研究主要通過檢測鐵蛋白、轉鐵蛋白等來研究熱量限制是否對老年小鼠肝臟的鐵死亡有作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

18月齡雄性C57BL/6J老齡小鼠24只,體質量(323)g,由山西醫科大學實驗動物中心提供。小鼠適應2-3 d后,采用數字表法隨機將其分為3組(n=8)。自由飲食組(AL組):混合飼料喂養,飲水飼料供應充足,保持墊料干燥;熱量限制組(CR組):混合飼料分籠喂養,自由飲食1周,計算平均初始每日食量,以后每2周減少初始食量的10%,6周共減30%,建立熱量限制模型[5]。SIRT1抑制劑組(SI組):在熱量限制模型的基礎上,第7周連續腹腔注射0.3 mg EX-527(SIRT1抑制劑,1652-10,Biovision 公司,美國)1周,1次/d[4]。7周后取肝組織檢測指標。

1.2 病理學組織染色

肝臟組織4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石臘包埋，切片厚5 μm，展片，烤片，二甲苯脫蠟，酒精至水，蘇木精-伊紅染色，或普魯士藍染色25 min，核固紅染色10 min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察肝小葉變化，肝細胞脂肪變情況及肝細胞形態結構變化。400倍鏡下隨機取40個視野，Image J軟件計數鐵小粒，取平均值進行統計學分析。

1.3 ROS和GSH含量檢測

取0.1 g肝臟組織研磨勻漿，預冷PBS稀釋至50倍待用。取100 μl樣品稀釋液與0.2 μmol/L DCFH-DA熒光染料等體積混合均勻，37 ℃溫箱避光孵育15 min。酶標儀激發波長499 nm、發射波長525 nm條件下檢測吸光度(A)。用分光光度法檢測肝組織ROS、GSH含量。以上操作均按說明書進行。

1.4 FTH、TFR和SIRT1蛋白水平檢測

取每只小鼠肝臟組織30 mg，加入400 μl裂解液，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度，用裂解液稀釋至80 μl，加入20 μl Buffer，95 ℃煮沸5 min。每份樣品取5 μl上樣量，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，進行濕法轉膜，用Western blot檢測FTR、TFR、SIRT1的蛋白含量。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入一抗，FTH(1 ∶1 000，YT4302,Immunoway公司，美國)、TFR(1 ∶1 000，UD282772,Invitrogen 公司，美國)、SIRT 1(1 ∶1 000，abx000615,Biovision 公司，美國)、內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶單克隆抗體GAPDH(1 ∶1 000，3777R-100， Biovision 公司，美國)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后FTH膜中加入二抗(1 ∶1 000，A21230 Biovision 公司，美國)，TFR、SIRT 1、內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶單克隆抗體GAPDH膜中加入二抗(A25022,Biovision 公司，美國)，室溫孵育2 h，洗膜，曝光儀曝光顯影。Image J軟件測定條帶灰度值，通過目的條帶與內參灰度值的比值反映相關蛋白的表達。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 病理學染色觀察

HE染色觀察到AL組肝小葉結構破壞，肝細胞體積變大，胞漿內可見大量大小不等的脂肪空泡；CR組肝小葉結構基本正常，肝細胞為圓形，細胞核居中，胞漿內少見脂滴，排列方式為條索狀且肝竇不狹窄；SI組肝細胞脂滴增多，其病理改變較AL組明顯減輕，可見到正常的肝細胞，肝細胞脂肪變性程度較輕(見圖1)。普魯士藍染色觀察鐵小粒，與AL組相比，CR組和SI組鐵小粒含量顯著降低(P<0.05)；與CR組相比，SI組鐵小粒含量顯著增高(P<0.05，見圖2，表1)。

圖1 肝臟組織切片HE染色 (×200)Figure 1 HE staining of liver tissue in mice (×200)

圖2 肝臟組織切片普魯士藍染色 (×400)Figure 2 Prussian blue staining of liver tissue in mice (×400)

2.2 肝組織ROS和GSH含量檢測結果

與AL組相比,CR組和SI組ROS含量顯著降低(P<0.05),GSH含量顯著升高(P<0.05);與CR組相比,SI組ROS含量顯著增高(P<0.05),GSH含量顯著降低(P<0.05,見表1)。

表1 各組小鼠鐵小粒、ROS和GSH含量的比較Table 1 Comparison of iron granule,ROS,GSH contents in mice between three

2.3 Western blot分析結果

與AL組相比,CR組和SI組TFR表達量顯著減少(P<0.05),FTH表達量顯著增多(P<0.05);CR組SIRT1蛋白表達量顯著增高(P<0.05),SI組SIRT1蛋白表達量減少(P<0.05)。與CR組相比,SI組TFR表達量顯著增多(P<0.05),FTH,SIRT1蛋白顯著減少(P<0.05,見圖3,表2)。

圖3 Western blot檢測TRF、FTH、SIRT1和GAPDH蛋白表達Figure 3 The protein expression of TRF, FTH, SIRT1 and GAPDH were detected by Western blot

3 討論

在衰老的過程中伴隨著鐵死亡的發生,鐵死亡是導致器官衰老的機制之一。熱量限制被證明是一個有效的延緩衰老的非藥物治療方法,但熱量限制與鐵死亡之間是否相關尚無文獻報道。本研究發現熱量限制通過影響鐵代謝相關蛋白及氧化反應而抑制肝臟鐵死亡的發生。

鐵死亡的特征是鐵依賴的脂質過氧化的發生。氧化應激水平是衡量鐵死亡程度的主要指標[6]。鐵死亡抑制細胞胱氨酸運輸蛋白,耗竭胞內GSH;同時,谷胱甘肽過氧化物酶(GPX4)失效[7]造成膜脂活性氧自由基堆積(ROS)。鐵死亡過程伴隨著FTH含量顯著降低[8]和轉鐵蛋白含量增高[9]。FTH是一種包含24條重鏈和輕鏈的多亞基聚合物,通過儲存調節細胞鐵代謝[10]。TFR則將血中二價鐵離子轉運至細胞膜,經過TFR受體進入細胞內;干擾TFR表達可降低鐵死亡發生。本研究通過檢測ROS和GSH含量及FTH、TFR水平,提示熱量限制減輕了老年小鼠肝臟鐵死亡的程度,可能是通過調節鐵代謝途徑而實現。

組蛋白去乙?；?(SIRT1)是熱量限制的關鍵蛋白之一,以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)為輔酶,可通過調控抗氧化酶減少氧化應激的發生,起到延緩衰老的作用[11, 12]。本研究結果發現,使用SIRT1抑制劑EX-527一定程度上促進了鐵死亡的發生,驗證了熱量限制對鐵死亡的抑制作用。

綜上所述,本研究發現熱量限制可以通過調節鐵代謝相關蛋白及氧化應激反應顯著減輕老齡小鼠肝臟鐵死亡水平,SIRT1抑制劑在一定程度上可取消該作用,具體的機制有待進一步研究。