白楊素衍生物對谷氨酸誘導的HT22 細胞損傷保護作用的研究

熊浙徽，張惠惠，張自清，馬騁晨，齊 宇，李紅俠

（宿州學院，安徽宿州 234000）

白楊素又名1，2-苯并吡喃酮，屬于黃酮類化合物，可從紫葳科植物木蝴蝶中提取，尤其蜂膠中含量較高［1-2］，它具有多種生物活性和藥理作用［3-7］.谷氨酸是中樞神經系統信號傳遞的主要遞質之一，對維持中樞神經系統的穩定具有重要的作用［8］.當谷氨酸濃度過高時，會引發氧化應激反應，產生大量氧化中間產物，導致線粒體功能受損，進而產生更多的氧自由基，加重細胞的損傷、衰老和死亡.近年來研究發現腦缺血［9-10］、肌萎縮側索硬化癥、帕金森氏癥、阿爾茨海默?。?1-13］等神經性疾病均是由谷氨酸釋放量過高引起的.臨床研究表明，由神經損傷引起的疾病發病率、復發率、致殘率、致死率都較高，但有效治療藥物少，治愈率低［14］.

HT22細胞系是小鼠海馬神經元細胞系，來自HT4.正常狀態下貼壁生長，普通DMEM 培養基加上血清，雙抗即可培養.該細胞系是體外研究谷氨酸毒性的良好模型，在很多神經退化性疾病，例如阿爾茨海默病和帕金森中均有很好的應用.本實驗以谷氨酸誘導HT22 細胞建立模型，通過加入白楊素衍生物，研究白楊素衍生物對神經細胞的保護作用，以期為相關疾病的治療提供借鑒依據.

1 實驗儀器、材料及試劑

1.1 實驗儀器

本實驗所用儀器主要有掃描酶標儀（Sunrise，奧地利TECAN），流式細胞儀（C6，BD 公司），CO2培養箱（Heracel，美國Kendro），倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS CX -40，日本OLYMPUS），激光共聚焦顯微鏡（FV1200+IX83，日本Olympus），96孔細胞培養板和共聚焦專用小皿，96孔細胞培養板和6孔細胞等.

1.2 實驗材料與試劑

實驗材料為HT22細胞株，由中國科學院上海細胞生物學研究所提供.

實驗所用試劑有DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（北京索萊寶生物科技有限公司），雙抗、MTT（碧云天生物技術有限公司），線粒體膜電位檢測試劑盒和活性氧檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），白楊素衍生物由宿州學院化學實驗室提供，以下以CD表示.

2 實驗方法

2.1 細胞存活率測定

將處于對數生長期的HT22細胞分為對照組（完全培養基培養24 h）、模型組也稱谷氨酸處理組（細胞正常培養12 h 后，與谷氨酸作用24 h）和藥物組（細胞正常培養12 h 后加10 mmol/L 谷氨酸1h，然加終濃度為2.5、5、10 μmol/L 的白楊素衍生物繼續培養24 h）.白楊素衍生物終濃度為2.5、5、10、25 μmol/L，谷氨酸濃度10 mmol/L.

將對數生長期的HT22細胞，按每孔2×105細胞培養于96 孔板中，每孔加入100 μL，每組3個重復，待細胞貼壁后，對照組加入100 μL的完全培養基，模型組加入100 μL含谷氨酸濃度10 mmol/L的完全培養基，藥物組加谷氨酸濃度10 mmol/L，1 h后，加藥物CD的終濃度分別為2.5、5、10 μmol/L，繼續培養（培養箱溫度37℃，CO2濃度5%），24 h 后加MTT（濃度5 mg/mL，每孔15 μL），繼續孵育4 h 后，棄去每孔的液體，加150 μL 的二甲亞砜，于水平搖床震蕩8 -10 min，用酶標儀檢測490 nm 處的吸光度值（A）和細胞存活率，細胞存活率計算公式如下：細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值/對照組OD值-空白對照組OD值）x 100.

2.2 細胞線粒體膜電位檢測

將HT22 細胞接種于共聚焦專用細胞培養皿中，按實驗分組，對照組、谷氨酸組、藥物組24 h后，棄去培養液，采用JC-1 試劑盒檢測HT22 細胞線粒體膜電位，加入10 μg/mL JC-1 染液，于37 ℃下孵育20-25 min，用置于冰浴下的JC-1 染色緩沖液（1X）洗3 遍，加入1.5 mLDMEM 培養液，于激光共聚焦顯微鏡下在激發光為488和Cy3下，采集熒光信號.當線粒體膜電位低時，JC-1產生綠色熒光；當線粒體膜電位高時，JC-1 產生紅色熒光，通過Image J 軟件進行平均熒光強度的半定量分析，以紅/綠相對熒光強度比來反映線粒體膜電位的變化.

2.3 細胞活性氧檢測

將HT22 細胞接種于共聚焦專用細胞培養皿中，按實驗分組，對照組、谷氨酸組、藥物組24 h后，棄去培養液，采用ROS Assay Kit 試劑盒檢測HT22 細胞線粒體內ROS 水平.加入終濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA，于37 ℃細胞培養箱孵育25 min 左右，用不含血清的細胞培養液洗3 遍后，加入1.5 mLDMEM 培養液，于激光共聚焦顯微鏡在FITC 的參數設置下，采集熒光信號，通過Image J 軟件進行平均熒光強度的半定量分析.

2.4 AV/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡

用Annexin V/PI 流式細胞儀來檢測神經細胞HT22的凋亡，將對數生長期的HT22細胞接種6孔板（2×108個/mL細胞），根據實驗分組，分組方法同活性氧，對照組加相同量的細胞培養基.培養結束后（24 h），將細胞收集，PBS（冷的）漂洗2次，懸浮于300 μL Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC/PI染色5 min后，再加入5 μL PI，輕振混勻，再加200 μL Binding Buffer，室溫避光反應15 min，上機檢測.用Flowjo7.6.1（FACSCA2BUR，Becton Dickinson，USA）軟件進行數據分析及出圖.

3 結果與分析

3.1 藥物CD的性狀

藥物CD為淺黃色固體粉末，熔點187℃～190℃，分子量525.38，分子式C27H22Cl2N2O5.

3.2 藥物對谷氨酸誘導的神經細胞存活率的影響

由圖1a 可知，藥物CD 對HT22 細胞存活率的影響，隨著藥物濃度的增加而降低，因此，適宜的藥物濃度用量在2.5～10 μmol/L.圖1b顯示，10 mmol/L的谷氨酸處理24 h，谷氨酸模型組與對照組細胞相比較存活率下降一半，其存活率為50.111±0.34%，具有統計學極顯著性差異.藥物處理組與模型組比較，藥物處理濃度為2.5、5、10 μmol/L 時，存活率為61.819±0.23%、71.688±0.56%、83.223±0.72%，細胞存活率顯著升高.當藥物濃度為10 μmol/L 時，細胞存活率達到最高，比模型組高出1.66 倍，且具有統計學極顯著性差異.藥物處理組提高了細胞的存活率，可以降低谷氨酸對HT22細胞的損傷.

圖1 藥物（CD）對細胞存活率的影響（，n=3）

3.3 藥物對HT22細胞線粒體膜電位的影響

由圖2可知，與對照組比，谷氨酸組和藥物組（CD 分別為2.5，10μmol/L，加10 mmol/L谷氨酸）細胞紅/綠相對熒光強度比均顯著降低（P＜0.01），HT22 細胞線粒體膜電位均顯著下降，但藥物組處理后，細胞線粒體膜電位較模型組升高.隨著藥物濃度的增加，細胞線粒體膜電位顯著增加（P＜0.01）.說明藥物對谷氨酸損傷有一定的保護作用.

圖2 藥物（CD）對HT22細胞線粒體膜電位的影響

3.4 藥物對HT22細胞活性氧的影響

由圖3 可見，與對照組比，谷氨酸組和藥物組（CD 分別為2.5，10μmol/L，加10 mmol/L 谷氨酸），HT22細胞內相對熒光強度均顯著增加（P＜0.05），谷氨酸組達到極顯著增加（P＜0.01），但藥物處理組與模型組相比，細胞內相對熒光強度均降低，且隨藥物濃度增加而降低，說明對細胞的損傷程度也隨之降低.

圖3 藥物（CD）對HT22細胞線粒體內ROS水平的影響

3.5 藥物對細胞凋亡的影響

使用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞術，24 h后檢測各組HT22細胞的凋亡變化，圖4是流式細胞儀的散點圖，圖中C表示活細胞，即FITC-/PI-；D表示早期細胞凋亡，即FITC+/PI-；B表示晚期凋亡，即FITC+/PI+；A表示死亡細胞，即FITC-/PI+.模型谷氨酸組，細胞凋亡率為34.81%，是對照組的18.82倍，藥物處理組，當藥物濃度為2.5 μmol/L+10 mmol/L谷氨酸，細胞凋亡率為23.57%，較模型組下降11.24%，藥物濃度為10 μmol/L+10 mmol/L谷氨酸，細胞凋亡率為12.25%，較模型組下降22.56%，由此看出，藥物對谷氨酸損傷的保護作用隨藥物濃度（2.5-10 μmol/L）的增加而增強.

圖4 谷氨酸誘導的HT22細胞經不同濃度藥物處理后的細胞凋亡

4 結論

關于谷氨酸誘導細胞損傷導致的疾病，其治療藥物稀缺，去尋找和研究有效的藥物對于治療由谷氨酸誘導的細胞損傷具有重要的意義.實驗結果顯示，10mmol/L 的谷氨酸處理的HT22 細胞24 h 后，細胞存活率明顯降低，線粒體膜電位顯著降低，活性氧顯著增強，細胞的凋亡率顯著升高；當給與白楊素衍生物的藥物CD培養HT22細胞24 h，與模型組比較，細胞存活率顯著增加，在藥物CD 濃度為2.5-10 μmol/L 時，處理效果較好.線粒體膜電位較模型組顯著升高，活性氧較模型組下降，細胞凋亡較模型組降低.研究結果表明，白楊素衍生物能夠保護谷氨酸誘導的HT22細胞損傷.