潰瘍性結腸炎與濕熱證潰瘍性結腸炎大鼠模型的比較研究

李沁媚,王玉涵,呂菲菲,徐百昌,崔瑤,彭小敏,王潁,司紅彬

(廣西大學動物科學技術學院,南寧 530004)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)屬于炎性腸病之一,主要病理變化為乙狀結腸和直腸黏膜及黏膜下層的炎性損傷。UC在歐洲和北美的平均患病率超過0.3%,其中挪威的發病率高達0.5%[1]。值得注意的是,亞洲國家的炎性腸病發生率和患病率較歐美地區偏低,然而90年代成為亞、非等國的炎性腸病發病率的轉折點,尤其是韓國和中國香港等亞洲地區的發病率明顯增加[2-3]。UC已經發展成為一種全球性疾病,因其反復發作和長期治療的特性被稱為“綠色癌癥”,因此受到了越來越多的關注。

濕熱證(damp-heat syndrome,DH)是中醫常見證候,多因感受濕熱外邪、喜食肥甘厚膩、嗜酒、飲食不節等因素引起機體內釀濕生熱、濕熱交蒸。2017年《潰瘍性結腸炎中醫診療專家共識意見》中指出活動期UC多屬實證,主要病機為濕熱蘊腸[4],大腸濕熱證是UC活動期最重要的證型[5]。盡管目前有少量關于濕熱病因所致UC的免疫標識物的報道[6],然而濕熱因素在UC疾病發展進程中的影響及機制尚不完全清晰。

目前國際較為認可的造模方法是葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS),其誘導的結腸炎模型因其簡單性和與人類潰瘍性結腸炎的許多相似性而被廣泛使用[7-9],前期總結了近年來中藥防治濕熱證的藥效作用及機制研究[10],為進一步研究UC發病機制及中藥療效機理,選擇使用“DSS”和“DSS+復合因素”分別構建普通UC大鼠模型和濕熱證UC大鼠模型,通過對比這兩種模型,試圖說明普通UC與濕熱證UC的區別與聯系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

24只7～8周齡SPF級SD大鼠,雌雄對半,體重200～220 g,由長沙市天勤生物技術有限公司提供【SCXK(湘)2019-0014】。飼養于廣西植物研究所生物技術中心屏障環境動物室【SYXK(桂)2020-0002】,飼養環境保持12 h的明暗循環,溫度(24±2)℃,相對恒定的濕度(50%±10%)。大鼠維持飼料購自北京科澳協力飼料有限公司,常規標準喂養,自由飲水。所有操作均遵守廣西大學實驗動物管理和倫理委員會準則(審批號:2019-084)。

1.1.2 主要試劑與儀器

DSS(MP Biomedicals,Q8378),冠生園蜂蜜(上海冠生園,SC12731012000317),牛欄山二鍋頭(北京順鑫,56%vol),豬油購自南寧大康惠超市,二甲苯(國藥集團,10023418),中性樹膠(國藥集團,10004160),HE染液(上海照華,G1005),分化液(上海照華,G1005-3),返藍液(上海照華,G1005-4),大便隱血檢測試劑盒、二胺氧化酶(DAO)、髓過氧化物酶(MPO)測試盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒均購自南京建成生物公司(C027-1-1,AO88-1-1,A044-1-1,A006-2-1,A003-1-2),大鼠皮質醇(Cortisol)、大鼠熱應激蛋白(HSPs)、總蛋白定量測定、大鼠白細胞介素10(IL-10)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、大鼠巨噬細胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、大鼠巨噬細胞炎性蛋白1β(MIP-1β)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自江蘇酶免實業有限公司(MM-0574R1,MM-0686R1,MM-2002577,MM-0195R1,MM-0104R1,MM-0180R1,MM-2002577)。

高速組織研磨儀(塞維爾,KZ-II,武漢),酶標儀(賽默飛世爾,Multiskan FC,上海),洗板機(Thermo Labsystems,AC8,芬蘭),離心機(Eppendorf AG,810R,德國),分析天平(菁海,FA1004,上海),恒溫水浴鍋(金壇市醫療,HH-S4,金壇),正置光學顯微鏡(尼康,Nikon Eclipse E100,日本),紫外分光光度計(津島制作所,UVmini-1240,日本),恒溫生化培養箱(精宏,BPH-9162,上海),智能恒溫恒濕培養箱(生元,LHS-250,鄭州),全自動動物生化分析儀(優利特,URIT-8021Vet,桂林)。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模

24只SD大鼠,在1周適應期結束后,隨機分為空白對照組、UC組、UC+DH組,每組8只。實驗周期29 d,各組造模方式(圖1)如下:

圖1 造模方式Figure 1 Modeling method

(1)空白組自由采食與飲水,飼養環境的溫濕度和明暗度與適應期一致,直至試驗期結束。

(2)UC組大鼠在實驗周期前22 d與空白組一致,第23天起自由飲用5%DSS溶液。

(3)UC+DH組大鼠在前14 d里,自由飲用蜂蜜水,單號管飼4 mL豬油,給與充足飼料,雙號禁食不禁飲,經受饑飽交替;第15～22天,自由飲用蜂蜜水,自由采食普通飼料,每日管飼2 mL二鍋頭,每日需進入恒溫恒濕箱中33℃～35℃,濕度為(95±3)%6 h;第23天開始,自由飲用5%DSS溶液,自由采食高糖飼料,每日需進入恒溫恒濕箱中33℃～35℃,濕度為(95±3)%6 h。

1.2.2 一般情況觀察

大鼠適應性喂養1周后,進行造模。注意飲用DSS期間的體重變化,飲用DSS前1 d給大鼠稱體重,將其作為原始體重,每日早上10:00測體重,尤其記錄體重增長率,觀察每日的糞便性狀、血便情況、腹瀉程度,進行疾病活動指數(disease activity index,DAI)評分[11]。

1.2.3 樣本采集及處理

戊巴比妥(40 mg/kg,BW)麻醉大鼠后,用無菌EP管收集血液,室溫下靜置0.5 h后放入4℃冰箱,冷藏1 h后經2000 r/min轉速離心取淡黃色澄清上清液,備用。采用二氧化碳窒息法處死大鼠,用手術刀剪剖開腹腔,完整取出盲結腸段,記錄結腸長度,收集結腸樣品,經液氮冷凍后,轉移至-80℃冰箱中保存。

1.2.4 結腸病理組織學檢測

模型組大鼠結腸組織病變明顯處取1.5 cm環狀腸腔,其余組取該組大鼠結腸對應位置,選材部位盡量保持一致,然后置于10%中性福爾馬林緩沖液中,24 h后進行脫水、浸蠟、包埋、石蠟切片、脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片、鏡檢集圖。病理生物學切片采用盲法評估,根據既往研究依據以下參數進行評分:僅結構改變、炎癥、固有層中性粒細胞、上皮中性粒細胞、隱窩破壞、糜爛或潰瘍。通過病理切片觀察腸道黏膜損傷程度,進行Geboes標準分級評分[12]。

1.2.5 血清生化檢測

用1000μL移液槍從上述血清,抽取400μL放入生化檢測杯中,將血清樣品放入全自動生化檢測儀檢測血清中的甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、血糖(GLU)、膽固醇(CHOL)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)含量。

1.2.6 ELISA法檢測皮質醇和熱應激蛋白的表達

根據酶免試劑盒說明書檢測血清中的皮質醇和結腸HSPs的含量。

1.2.7 血清DAO含量的測定

采用南京建成試劑盒說明書方法,檢測血清中的DAO含量。

1.2.8 結腸MPO、MDA、GSH的測定

4℃冷藏的0.86%生理鹽水與結腸組織按9∶1比例混合,經研磨儀研磨后,低溫離心機轉速2000 r/min,在離心15 min后取勻漿上清,制備成不同濃度的結腸上清液,采用南京建成試劑盒說明書方法,檢測結腸中MPO、MDA、GSH含量。

1.2.9 ELISA法檢測結腸細胞因子變化

稱取1 g結腸組織,加入9 mL的pH=7.2～7.4的PBS,用研磨儀將標本勻漿充分。離心20 min左右(2000～3000 r/min),仔細收集上清。根據組織總蛋白定量測定試劑盒說明書提取蛋白樣品,采用BCA法對蛋白樣品進行定量,按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠IL-10、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β。

1.3 統計學分析

實驗數據采用SPSS 21.0和Graph Pad Prism 8軟件處理,數據滿足正態分布,方差齊性的情況下,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行兩兩比較,假定方差齊性使用LSD法分析,假定方差不齊使用Dunnett’s T3法分析,結果以平均值±標準差(±s)表示,以P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結果

2.1 一般情況

造模前,所有大鼠精神良好、毛色整潔光亮、飲食量飲水量俱佳、糞便干燥、無腹瀉及肉眼血便情況,取新鮮糞便經南京建成大便隱血檢測試劑盒檢測均呈陰性,無隱血便可能。造模開始后,前22 d,正常環境下的大鼠,食欲良好,體重持續增加,濕熱環境下的大鼠食欲由起初良好轉為不佳,體重持續增長,但體重增長幅度由大轉小。第23～30天,UC組與UC+DH組開始飲用5%DSS,飲用DSS初期,體重均有所增長(圖2A),隨著DSS刺激機體腸道產生炎癥,糞便性狀改變,出現腹瀉血便等癥狀。與空白對照組相比,兩類模型組大鼠體重增長幅度呈現不同程度的改變甚至下降,DAI指數顯著升高;與UC組相比,UC+DH組的體重降低程度更為嚴重,DAI指數進一步顯著升高(圖2B)。

2.2 結腸長度

與空白對照組比較,兩組模型大鼠結腸的長度顯著縮短,具有顯著性差異(P<0.05)(見圖3A);與UC組比較,UC+DH組結腸的長度顯著性縮短(見圖3B)。

圖3 各組結腸長度變化Note.A.Length of the colon shown here has been removed from the anus.B.Compared with control group,***P<0.001.Compared with UCgroup,###P<0.001.Figure 3 Changes in colonic length in each group

2.3 結腸組織病理學改變

正常大鼠結腸黏膜由柱狀上皮、黏膜下層、黏膜肌層及外膜組成,如圖4A所示,空白對照組大鼠結腸形態完整,腸腺排列規則,固有層內杯狀細胞豐富,黏膜下層未見充血水腫、潰瘍,未見炎癥細胞浸潤。與DAI評分和臨床癥狀發現一致,DSS引起明顯的炎癥并破壞了結腸隱窩結構,UC組大鼠出現的結腸腸腺大面積消失,腺體變形,杯狀細胞丟失,黏液減少,炎細胞浸潤,造成嚴重的腸上皮損傷。與UC大鼠相比,UC+DH組大鼠結腸的腸腺幾乎消失殆盡,腸上皮空泡隨處可見,由此可知濕熱環境與DSS能夠協同加劇腸上皮結構的破壞。UC組與UC+DH組大鼠的Geboes指數顯著高于空白組大鼠(P<0.001),說明單純飲用DSS溶液與濕熱環境下飲用DSS溶液造成了大鼠結腸黏膜的嚴重損傷。與UC大鼠相比,UC+DH組大鼠的Geboes指數顯著增加(P<0.05)(圖4B)。

圖4 各組結腸黏膜病理變化及評分Note.Compared with control group,***P<0.001.Compared with UC group,#P<0.05.Figure 4 Pathological changes and Geboes score of colonic mucosa in each group

2.4 血脂水平的變化

與空白組相比,UC組大鼠血清中的TG、CHOL、HDL_C、LDL_C、GLU濃度無顯著性差異(P>0.05)。與空白組和UC大鼠相比,UC+DH組大鼠TG、CHOL、LDL_C顯著增加(P<0.001),GLU含量有所增加(P<0.05),HDL_C含量顯著降低(P<0.001)(圖5)。

圖5 血脂水平變化結果Note.Compared with control group,**P<0.01,***P<0.001.Compared with UC group,#P<0.05,###P<0.001.Figure 5 Changes in lipid levels in each group

2.5 肝功能的變化

與空白組相比,UC組大鼠的ALP、LDH、ALT、AST顯著增加(P<0.05),UC+DH組ALP、LDH、ALT、AST濃度顯著提升(P<0.05)。與UC組大鼠相比,UC+DH組的ALP、ALT、AST含量進一步顯著升高(P<0.01)(見圖6)。

圖6 肝功能變化結果Note.Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.Compared with UCgroup,###P<0.001.(The same in the following figures)Figure 6 Results of liver function changes

2.6 皮質醇、熱應激蛋白和DAO的變化

與空白組相比,UC組和UC+DH組大鼠血清中的皮質醇含量顯著增加(P<0.001),說明DSS能顯著增加大鼠血清中皮質醇含量。其中,與UC組大鼠相比,UC+DH組的皮質醇含量進一步增加(P<0.001)(圖7A),說明濕熱證能進一步增加血清皮質醇含量。

與空白組相比,UC組大鼠結腸中的HSPs含量無顯著性差異(P>0.05),說明DSS對HSPs的表達沒有明顯的影響。與空白組和UC組大鼠相比,UC+DH組大鼠結腸中的HSPs含量顯著增加(P<0.001)(圖7B),說明濕熱因素能顯著增加大鼠血清中皮質醇含量。

與空白組相比,UC組和UC+DH組大鼠血清中的DAO含量顯著增加(P<0.001),說明DSS能顯著增加大鼠血清中DAO含量。其中,與UC組大鼠相比,UC+DH組的DAO含量進一步增加(P<0.001)(圖7C),說明濕熱因素能協同DSS進一步增加血清DAO含量。

圖7 大鼠血清皮質醇、DAO濃度和結腸熱應激蛋白表達情況Figure 7 Serum cortisol and diamine oxidase concentrations and colonic heat stress protein expression in rats

2.7 結腸氧化應激反應及抗氧化能力結果

經DSS誘導后,與空白組相比,UC組和UC+DH組大鼠的MPO、MDA含量顯著升高(P<0.001),結腸中的GSH含量顯著降低(P<0.001),說明DSS能導致機體的脂質過氧化,降低大鼠抗氧化能力;與UC組大鼠相比,UC+DH組的MPO、MDA含量進一步增加(P<0.001)(圖8A、B),結腸中的GSH含量進一步降低(P<0.01)(圖8C),說明濕熱因素能協同DSS過度激活氧化應激反應,抑制機體抗氧化能力。

圖8 各組大鼠氧化應激反應及抗氧化能力Figure 8 Oxidative stress reaction and antioxidant capacity of rats in each group

2.8 結腸炎癥細胞因子的水平

與空白組相比,UC組和UC+DH組大鼠的TNF-α、MIP-1α、MIP-1β 表 達 顯 著 升 高(P<0.001),結腸中的IL-10含量顯著降低(P<0.001),說明DSS具有促炎作用;與UC組大鼠相比,UC+DH組的TNF-α、MIP-1α、MIP-1β濃度進一步增加(P<0.01)(圖9A、B、C),結腸中的IL-10含量進一步降低(P<0.001)(圖9D),說明濕熱因素能協同DSS加重腸道炎癥程度。

圖9 大鼠細胞因子的表達情況Figure 9 Expression of cytokines in rats

3 討論

中醫將潰瘍性結腸炎歸屬于“痢疾”“久痢”和“腸澼”等病范疇[4,13]。UC表現為血性腹瀉、腹痛、黏液性膿便、里急后重、體重減輕等,這些癥狀可導致患者身體狀況和心理的衰弱,并加重全球經濟負擔[14]。伴隨UC確診而來的是患結直腸癌及手術切除、術后并發癥和UC腸外并發癥(肝膽疾病、骨質疏松、關節炎、皮膚病等)的風險,數據表明,DSS與DSS協同濕熱因素可引起不同程度的肝功能損傷和腸黏膜損傷,其中DSS協同濕熱因素給機體造成的損傷尤為嚴重。

DAO是一種催化二胺氧化的細胞內酶,位于腸黏膜上層絨毛膜上皮細胞的胞質中,與腸黏膜內的核酸和蛋白質合成密切相關。DAO大部分來源于腸黏膜,正常狀態下血清中的含量極少,當腸上皮細胞破損時,腸黏膜中的DAO經受損部位入血,因此血清DAO水平可作為腸黏膜損傷的理想指標,可作為IBD的主要診斷指標[15-16]。本研究中兩種模型大鼠的血清DAO含量升高的結果也支持了這一理論。熱應激引起肉雞腸道屏障功能紊亂并提高腸道通透性,導致血清DAO水平升高[17]。在本研究中,濕熱證UC大鼠的血清DAO遠高于UC大鼠的水平,可能與濕熱證UC大鼠受到的濕熱刺激有關,說明濕熱應激和UC在促炎和損傷腸屏障方面可能具有協同作用,具體機制需要進一步的研究證明。

在本研究中,發現UC模型大鼠與濕熱證UC模型大鼠最明顯的區別在于血脂和熱應激蛋白的表達水平差異。通過復合因素“高脂高糖飲食+飲酒+饑飽交替+高溫高濕環境+5%DSS”構建的濕熱證UC大鼠表現出高脂血癥和熱應激反應。與前人報道一致[18],本研究中濕熱證UC大鼠血清中的TG、CHOL、LDL_C、GLU水平顯著高于普通環境下的UC大鼠(P<0.05),且血清中的HDL_C低于普通環境飼養的UC大鼠(P<0.05),說明實驗周期內的高脂高糖酗酒的飲食習慣配合高溫高濕的生活環境,能成功打造高血脂癥狀的大鼠,高脂血癥可能是濕熱證潛在的生物基礎之一。熱休克蛋白(HSPs)的誘導被稱為熱休克反應(HSR)。HSR在細胞防御系統中起著關鍵作用,在該系統中,HSP充當蛋白質伴侶,覺察到氧化損傷并修復未折疊或折疊錯誤的蛋白質,保護細胞免受應激誘導的傷害,有助于提高預處理刺激后產生的細胞存活率[19]。HSPs是細胞內高度保守的蛋白,在應激條件下可以存在于細胞外液中。實驗數據也表明濕熱應激能增加大鼠結腸組織中的HSPs表達。HSP參與了多種信號傳導途徑,包括氧化應激途徑[20]。Dangi等[21]認為HSPs的高峰表達是山羊長期熱應激期間的一種適應機制,抗氧化劑可能會通過降低氧化應激而減弱HSPs表達。因此檢測了結腸中的MPO、MDA、GSH濃度的變化。

既往研究表明,腸道黏膜損傷的關鍵因素之一是氧化-抗氧化失衡[22]。氧化應激反應過度激活可以抑制抗氧化酶,促進結腸細胞中活性氧增多,活性氧本身具有細胞毒性,引起蛋白質變性和酶激素失活。同時活性氧可使不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應,造成生物膜損傷。MPO是一種存在中性粒細胞中的酶,活性大小與炎癥區域中的中性粒細胞濃度成正比,MPO活性增加是嗜中性粒細胞浸潤和炎癥的指標[23]。因此,MPO活性的測量被認為是急性腸道炎癥的定量和靈敏測定法。MDA可以通過蛋白質變性交聯作用影響膜蛋白,使其無法用作受體或酶,它是脂質過氧化的標志物[24-25],本研究中MPO、MDA活性的增加與結腸腸上皮層的大量喪失、漿膜炎性細胞浸潤、黏膜下層水腫、出血、壞死性潰瘍的出現有關。ROS的清除主要依靠體內的抗氧化酶完成,數據表明濕熱因素協同DSS共同抑制了結腸組織中的GSH活性,導致過量的ROS堆積,生物氧化失衡,從而加重濕熱證UC的氧化應激反應。

目前普遍認為,UC機體存在腸黏膜炎癥免疫耐受紊亂,腸黏膜免疫反應異常激活是UC發生、發展的重要因素。1988年Wolpe等[26]采用脂多糖刺激小鼠后,從小鼠巨噬細胞中分化得到炎性蛋白MIP-1。這種趨化性細胞因子在內毒素血癥、氧化應激反應、炎癥反應中具有廣泛的生物學活性,能觸發中性粒細胞產生過氧化氫,協同其他活性氧,過度激活氧化應激反應;同時MIP-1α可特異性地趨化單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞增殖并向炎癥部位遷移,誘導其釋放TNF-α、IL-6、IL-1等炎癥因子[27],具有潛在的促炎作用。有學者發現在嚴重發炎的腸粘膜中,表達MIP-1α和MIP-1β的細胞頻率明顯高于對照組[28]。在IBD中,抗原呈遞給抗原呈遞細胞(APC)以及APC與T輔助細胞的相互作用導致巨噬細胞的活化?；罨木奘杉毎a生廣泛活性的炎性細胞因子的混合物,包括TNFα、IL-1β,它們通過NF-kB途徑進一步增強炎癥反應,從而導致各種白介素以及細胞因子和趨化因子的上調[29-30]。在本研究中,推測DSS協同濕熱因素通過TNF-α將循環血中炎癥細胞募集至局部組織,誘導腸黏膜循環障礙,與MIP-1α和MIP-1β協同放大炎癥效應,破壞腸上皮固有層,誘導腸黏膜局部潰瘍,可導致UC的發生。

腸道中IL-10的主要來源是調節性T(Treg)細胞,IL-10可控制腸道中微生物和食物抗原的慢性刺激并保持免疫系統平衡[31]。因此被認為是人類最重要的抗炎細胞因子之一,IL-10可以限制促炎性細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12的分泌,防止對腸內穩態重要的Th1/Th17致病反應[32-33]。近日的一項研究表明,IBD中的抗TNF治療通過巨噬細胞IL-10信號傳導發揮治療作用[34]。反之,IL-10或其信號通路中降低或消除其抗炎特性的突變被認為參與了高炎癥性疾病的發病機制,如炎癥性腸病[35]。本研究中發現兩種環境下的UC大鼠結腸中的IL-10活性下降,與前述研究一致。Kühn等[36]在1993年開發IL-10缺陷(IL-10-/-)小鼠模型,顯示出與人IBD相似的組織學、生理學和生化特征。在IL-10-/-的情況下,幼稚T細胞分化為Th1或Th17以及增加引起自發性結腸炎的炎性細胞因子的產生[37],另一項研究評估了IL-10-/-BALBC小鼠12周齡時自發性結腸炎的預期發生率約為69%[38]。上述研究提供了可能的推理,濕熱環境協同DSS干預IL-10的信號傳導,加重腸道炎癥。

綜上所述,UC與濕熱UC模型既有區別又存在聯系,區別在于僅濕熱證UC模型存在高脂血癥與熱應激反應;聯系在于濕熱證UC模型的臟器損傷(肝、腸)嚴重程度高于UC模型,尤其是腸黏膜損傷。濕熱能加重UC的腸黏膜損傷,可能與濕熱促炎、促進脂質過氧化、抑制抗氧化、提高腸黏膜滲透性有關。相比經DSS誘導的普通UC大鼠模型,本研究通過復合因素構建的濕熱證UC模型更切合嶺南地區濕熱證UC患者實際,一定程度上為濕熱體質人群的UC辨證與防治提供參考。