心氣虛血瘀證動物模型的構建與評價

王云姣,張婉勤,張軍平,呂仕超

(天津中醫藥大學第一附屬醫院,天津 300193)

證候是證的外候,是疾病某一階段病理狀態的高度概括,是中醫學理論體系的核心內容。證候的物質基礎是中醫現代化研究的核心。借助多種現代技術手段,統一證候名稱,明確辨證分型,規范證候診斷標準,實現證候的標準化更是當務之急[1]。中醫學認為“有諸于內,必形諸于外”,證候的宏觀表現必定伴隨著微觀本質的改變[2],而深入探索證候的物質基礎,需要借助動物的證候模型。以中醫病因病機理論為基礎,利用特定致病因素,模擬疾病發生發展的特征,復制與人體證候特點相似的動物模型,是開展中醫證候研究的必要條件[3]。動物證候模型是基礎和臨床相互轉化的橋梁,也是中醫理論闡明與創新的重要方法。氣虛血瘀證是心系疾病的主要證候,其動物模型的研究對詮釋中醫藥防治心血管疾病的科學內涵具有重大意義。因此,本文以心氣虛血瘀證動物模型為切入點,梳理其造模與評價的方法,以期促進心氣虛血瘀證動物模型的規范化、標準化的進程[4]。

1 心氣虛血瘀證的科學內涵

《素問·痿論》云:“心主身之血脈”,心氣通過推動和調控血液在脈管內的正常運行以維持人體正常生理功能?！吨嗅t臨床診療術語國家標準(證候部分)》將心氣虛血瘀證定義為“心氣虛弱,運血無力,心脈瘀阻,以心悸氣短,胸悶心痛,神疲乏力,面色紫暗,舌淡紫,脈弱而澀等為常見癥的證候”。不同心系疾病氣虛血瘀證的特點存在差異,如《急性心肌梗死中西醫結合診療指南》[5]指出急性心肌梗死氣虛血瘀證以胸部刺痛、悶滯,活動后加重,可伴心悸短氣,汗出乏力,舌質黯淡或有瘀斑,苔薄白,脈虛無力或弦細無力為特征;《慢性心力衰竭中醫診療專家共識》[6]指出慢性心衰氣虛血瘀證表現為氣短/喘息、乏力、心悸為主,兼倦怠懶言,自汗,語聲低微,面唇紫暗等,舌質紫暗,苔白,脈沉、細或虛無力;《冠心病穩定型心絞痛中醫診療指南》[7]指出穩定型心絞痛氣虛血瘀證以胸痛胸悶,勞則誘發為特點,癥見心悸氣短,倦怠乏力,自汗,面色淡白或晦暗,舌黯淡胖大,脈沉澀。研究顯示,心氣虛血瘀證與心電圖、心功能、血流動力學等理化指標密切相關。心氣虛血瘀證患者心電圖ST段多為上斜型改變,心臟搏出量、心輸出量(cardiac output,CO)、心臟指數等明顯異常,紅細胞壓積(red blood cell specific volume,HCT)、纖維蛋白原等明顯升高[8]。目前,心氣虛血瘀證的研究多局限在以癥狀、體征、理化指標作為衡量標準,缺乏客觀量化的指標,極大地限制了中醫現代化的進程。

隨著科技進步,中醫證候的內涵不斷被揭示,運用基因組學、蛋白質組學、代謝組學等技術從生物學層面探討中醫證候的科學內涵[9]?；蚪M學研究顯示,冠脈介入術后氣虛血瘀組CYP2C19*2基因突變型與非氣虛血瘀組相比顯著升高,其突變可通過降低氯吡格雷的抗血小板作用進一步促進氣虛血瘀證的形成[10];通過對冠心病心絞痛氣虛血瘀證患者的基因集群研究,發現其與內分泌、炎癥反應及信號傳導等相關[11]。蛋白組學研究顯示,在冠心病不穩定型心絞痛氣虛血瘀證患者中,銅藍蛋白、血清淀粉樣蛋白、肌球蛋白H11及補體C6呈現高表達,而凝溶膠蛋白、載脂蛋白A4、血紅蛋白B及轉鐵蛋白等6種蛋白呈現為低表達[12];心衰氣虛血瘀證大鼠心肌線粒體中Stress-70、Nucleophosmin表達上調而ATP-α表達下調[13]。代謝組學研究顯示,心肌梗死恢復期氣虛血瘀證患者可能存在能量代謝、磷脂代謝、脂肪酸代謝紊亂,其體內花生四烯酸、溶血磷脂酰膽堿、亞油酸、鞘氨醇類物質的代謝水平均下調[14];不穩定型心絞痛氣虛血瘀證患者代謝產物中檸檬酸、氧化三甲胺、高密度脂蛋白等含量高于痰濁痹阻證組,而N-乙酰糖蛋白、低密度脂蛋白、天門冬氨酸等含量相比較低[15]。證候的科學內涵具有隱匿性、動態性和復雜性,與中醫治未病、整體觀念、辨證論治等理論相通,從基因、細胞、組織等不同層面,運用基因組學、蛋白質組學、代謝組學等方法探討證候的生物學基礎研究,可能進一步豐富氣虛血瘀證的科學內涵。

2 單因素誘導的心氣虛血瘀證模型

單因素誘導模型[16]是選用一種干預因素復制心氣虛血瘀證動物模型,多是通過藥物誘導、手術干預、生活環境干預等方式進行造模,復制出臨床上與心氣虛血瘀證表現一致的模型。

2.1 藥物造模法

藥物誘導是構建心氣虛血瘀證動物模型的重要方法之一。有學者運用去甲腎上腺素、阿霉素、丙基硫氧嘧啶等藥物復制心氣虛血瘀證模型,通過觀察動物一般狀態、心臟超聲、病理形態評價模型。運用去甲腎上腺素構建兔氣虛血瘀型充血性心力衰竭模型[17],結果顯示大耳白兔出現呼吸困難、活動減少、食欲不振等氣虛癥狀,左心室收縮壓(left ventricular systolicpressure,LVSP)、左室內壓變化速率(left ventricular pressure change rate,±dp/dtmax)顯著降低,左心室舒張期末壓(left ventricular enddiastolic pressure,LVEDP)、HCT、纖維蛋白原明顯升高,病理顯示部分心肌細胞空泡變性,心肌肌原纖維排列紊亂。運用阿霉素和丙基硫氧嘧啶復制慢性心力衰竭心氣虛兼血瘀水腫證大鼠模型[18-19],結果顯示大鼠出現精神不振、呼吸頻率加快、毛發枯槁、爪甲紫紺等癥狀,左室內徑縮短、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)降低,B型腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、心重指數升高,心肌細胞明顯腫脹。

2.2 冠狀動脈結扎法

通過結扎大鼠冠狀動脈前降支建立慢性心力衰竭模型[20-21],結果顯示術后第7天大鼠出現精神倦怠、活動度下降、呼吸頻率增加、毛發枯槁、口唇爪甲紫紺等癥狀,足底RGB值降低,術后第27～30天大鼠曠場實驗總運動距離縮短、游泳力竭時間下降,左室收縮末期內徑(left ventricular systolic diameter,LVEDs)、左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)、LVEDP、-dp/dtmax升高,左室短軸縮窄率(left ventricular minor axis decurtation rate,FS)、LVEF、LVSP、+dp/dtmax下降,體重、心臟質量、心臟指數明顯升高,病理顯示心肌壞死明顯,膠原纖維彌漫性生長,提示冠狀動脈前降支結扎術后第7～28天可以成功誘導慢性心衰氣虛血瘀證大鼠模型。

2.3 游泳力竭法

中醫學認為“勞則喘息汗出,外內皆越,故氣耗矣”,過度勞累易致耗氣,日久則致氣虛,氣虛無力運血導致血瘀。有學者通過游泳力竭模擬過度疲勞復制心肌缺血氣虛血瘀證大鼠模型[22],結果顯示大鼠出現體重下降、精神萎靡、反應遲鈍、游泳時間縮短、爪甲色淡、舌質紫黯等氣虛血瘀證癥狀,心率減慢,異常Q波增多,LVEDs、LVEDd增加,LVEF、FS下降,提示大鼠左心室功能下降[23-24]。

3 復合因素誘導的心氣虛血瘀證模型

復合因素誘導模型是采用2種及以上致病因素或中醫病因與西醫病理相結合的病證結合的方法復制心氣虛血瘀證動物模型,與單因素方法相比,復合因素方法更貼合臨床實際,是當前數量最多,涉及面最廣的一類方法[25]。

3.1 冠狀動脈結扎聯合其他因素法

病證結合造?？梢允窃谥嗅t“證”的基礎上建立西醫“病”的模型,根據中醫“谷不入半日則氣衰,一日則氣少矣”、“勞則耗氣”等理論,有學者通過冠狀動脈結扎聯合游泳加控食、睡眠剝奪、高脂飲食等因素構建心氣虛血瘀證動物模型,通過觀察動物一般狀態、心電圖、心功能、病理形態評價模型。例如,通過冠脈結扎聯合游泳控食法建立冠心病氣虛血瘀證大鼠模型[26-27],結果顯示大鼠出現精神萎靡、倦怠乏力、毛發枯槁、口唇青紫、舌質紫暗等癥狀,舌面RGB值下降,曠場實驗角落、周邊活動時間減少,中心活動時間延長,每搏輸出量(stroke volume,SV)、LVEF、組織型纖溶酶原激活劑含量降低,收縮末期容量、舒張末期容量、血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1、血管性假血友病因子含量增高,病理顯示心肌細胞排列紊亂,心肌細胞凋亡指數增大[28]。采用冠狀動脈結扎術聯合睡眠剝奪法可復制心力衰竭大鼠氣虛血瘀證模型[29],結果顯示大鼠倦怠懶行、毛發脫落、黯淡無光,體重、抓力、脈搏幅度及自主活動下降,舌面RGB值明顯降低,CO、SV、LVEF、FS降低,左室收縮末期容積、左室舒張末期容積、左室重量、LVEDs、LVEDd增加。此外,采用冠狀動脈結扎術聯合高脂飲食法復制高血脂狀態的冠心病氣虛血瘀證大鼠模型[30],結果顯示大鼠呼吸頻率加快,曠場內3 min自主運動距離、足底RGB均值下降,術后第7天心電圖出現6～8個病理性Q波,術后第7～28天總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇均顯著升高,LVEDs、LVEDd增加,LVEF、FS下降,提示該模型在術后第7～14天可辨證為氣虛血瘀證模型。

3.2 游泳力竭聯合其他因素法

通過強迫游泳可使大鼠出現氣虛癥狀,可在此基礎上聯合冰水負重法、高脂飲食法等因素構建心氣虛血瘀證動物模型。采用冰水負重游泳法建立氣虛血瘀證慢性心肌缺血大鼠模型[31],結果顯示大鼠心電圖ST段抬高總毫伏數最高,肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)明顯升高,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)降低,病理顯示其心肌梗死面積比例最大。采用力竭游泳聯合高脂飲食法[32]構建氣虛血瘀證大鼠模型,結果顯示大鼠出現毛發干燥易脫落、精神不振、活動度下降、納差、便溏、眼球暗紅、舌絳紫暗、尾部青斑或皮下瘀紫等氣虛血瘀癥狀,肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CKMB)、LDH、MDA升高,SOD降低,研究表明該方法建立的氣虛血瘀證模型可用于心血管疾病藥物的藥效評價。

3.3 其他多因素聯合法

根據中醫“驚則氣亂,勞則氣耗”、“寒凝血瘀”、“饑則損氣”、“甘肥貴人,則高粱之疾”等理論,多數學者提出采用驚恐、疲勞、寒濕、饑餓、高脂飲食等多因素復合方法復制氣虛血瘀證心力衰竭大鼠模型[33-34],通過觀察動物的一般狀態、血流動力學、血清學指標、病理形態評價模型。通過該方法構建心力衰竭氣虛血瘀證大鼠模型,結果顯示大鼠出現毛發枯槁、精神不振、活動無力、飲食不佳等氣虛癥狀,心率、收縮壓、舒張壓、血管緊張素II、腫瘤壞死因子-α、白介素-6水平升高,LVSP、LVEDP等下降,心臟病理顯示左心重量、左心質量指數增加,心肌細胞出現水腫、排列紊亂,并伴隨炎性細胞浸潤,細胞凋亡的陽性反應面積及凋亡指數明顯升高[35-36](見表1、2)。

表1 單因素誘導的心氣虛血瘀證模型Table 1 Single factor induced heart-qi deficiency and blood stasis syndrome model

4 小結

心氣虛血瘀證是心系疾病常見的證候類型,但臨床上不同心系疾病的氣虛血瘀證的證候表現不盡相同。心氣虛血瘀證與多項理化指標密切相關,運用基因、蛋白質、代謝組學等方法探討證候的生物學基礎研究,進一步體現了心氣虛血瘀證的科學內涵[37]。證候動物模型研究是推動中醫藥現代化發展的關鍵環節,模型評價是其重要內容,通常從模型動物的宏觀表現和微觀指標進行客觀評價,加強了模型科學性、穩定性和可復制性,促進中醫現代化進程[38]。但目前其研究仍處于探索階段,還存在以下不足[39-41]:一是缺乏公認、客觀的造模方法,病因造模法盡管可以模擬出所需證型,但人為因素較多導致操作性及穩定性差,而病證結合造模方法雖然符合中醫理論與臨床,但其操作困難、造模時間長、動物死亡率高,實驗可行性差;二是人與動物體質存在差異,人與動物生理機能不同,對病因的敏感性和耐受性不同,不同品種、年齡的動物對同一種造模方法產生的生理反應也不盡相同;三是疾病與證候關聯性不強,目前仍以西醫造模方法為主,注重現代醫學的病理檢測,忽視中醫證候臨床表現,導致疾病與證候關聯性不強;四是缺乏標準模型評價體系,目前評價動物模型的標準是建立在人的證候診斷標準上,故在判斷模型成功與否時缺少規范化、標準化評價。因此,中醫證候模型的建立可以從以下幾個方面著手[42-44]:(1)優化造模因素,多采用復合因素造模方法,將中醫“證”與西醫“病”結合,建立符合中醫理論與臨床實際的病證結合動物模型;(2)合理選用造模動物,應注重選擇與人體生理病理特點相近的動物以更好模擬臨床證型,從而提高造模成功率;(3)完善和規范證候動物模型評價體系,可依據中醫證候模型研究“生物表征”理論及“因、脈、證、治”建模思路?？傊?以中醫基礎理論為指導,現代科學技術為手段,建立客觀化、標準化的心氣虛血瘀證動物模型及其評價體系,為疾病的診療和預后提供了有力支持,可大大推動中醫藥現代化發展[45]。

表2 復合因素誘導的心氣虛血瘀證模型Table 2 Multiple factor induced heart-qi deficiency and blood stasis syndrome model