慢性高尿酸血癥腎損害大鼠模型的建立

劉冬戀,郭秋鴻,夏陽淼,周葉,李佳

(1.成都醫學院四川養老與老年健康協同創新中心,成都 610500;2.三六三醫院病案與統計科,成都 610041)

隨著人們飲食結構的改變和生活方式的變化,高尿酸血癥的發生率逐年增高,其對健康的影響也越來越受到人們的重視。高尿酸血癥與心血管疾病、腎病、糖尿病、高血壓等疾病密切相關[1-2]。導致尿酸升高的原因主要是尿酸生成過多或尿酸排泄減少,90%的高尿酸血癥與腎尿酸排泄減少有關[3]。高尿酸血癥也是慢性腎疾病發生發展的獨立危險因素[4]。因此,建立穩固的慢性高尿酸血癥腎損害動物模型,對發現有助于延緩慢性高尿酸血癥腎損害進展的新方法,具有重要的臨床意義。

人類由于缺乏尿酸酶,所以尿酸是嘌呤代謝的最終產物,但是其它大多數哺乳動物體內的尿酸酶可將尿酸降解為尿囊素而隨尿液排出,故而大多數動物體內血尿酸值較低,建立高尿酸血癥的動物模型非常困難[5]。同時,目前國內外尚無公認的慢性高尿酸血癥腎損害的動物模型。本研究參考了文獻報道的四種制造慢性高尿酸血癥腎損害動物模型的方法,通過每周眼眶取血的方式,動態的觀察大鼠體重、血清中的尿酸、肌酐、尿素氮等生化指標,然后對腎進行形態學觀察,考察和評價建立持續穩定的慢性高尿酸血癥腎損害動物模型的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

40只5～6周齡SPF級雄性SD大鼠,體重(220±10)g,成都達碩實驗動物有限公司提供【SCXK(川)2020-030】。飼養于成都醫學院科研實驗中心【SYXK(川)2020-196】。每只大鼠分籠飼養,飼養環境為室溫(22±2)℃、濕度50～60%、12 h光照/12 h黑暗交替。飼喂期間普通大鼠飼料(批號:20200901),購自成都達碩實驗動物有限公司。所有操作均符合成都醫學院實驗動物倫理學要求(編號:2020007)。

1.1.2 主要試劑與儀器

氧嗪酸鉀(批號:H2017151)、酵母浸膏(批號:K1914028)、腺嘌呤磷酸鹽(批號:D1402001)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;羧甲基纖維素鈉(批號:20190626)購自成都金山化學試劑有限公司;肌酐試劑盒(批號:20200907)、尿素氮試劑盒(批號:20200904)、尿酸試劑盒(批號:20200907)均購自南京建成生物工程研究所。HE染色試劑盒(批號:20200829)、尿酸鹽染色試劑盒(Gomori六胺銀法)(批號:20201202)、中性樹膠(批號:330A023)均購自北京索萊寶科技有限公司。

Centrifuge 5415D小型臺式高速離心機(德國eppendorf公司),CP225D精密分析天平(德國sartorious公司),Varioskan Flash酶標儀(美國Thermo公司),BX63正置熒光顯微鏡顯微鏡(日本Olympus公司),Leica RM 2016超薄切片機(美國feica公司),Specord 50 Plus紫外分光光度計(德國耶拿分析儀器股份公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模方法

將40只大鼠隨機分為5組(每組8只),分別為正常組、A、B、C、D組,具體分組及造模情況見表1。所有動物適應生活環境,自由進食和飲水,1周后開始實驗。每周眼眶取血1次,各組造模時間為5周。

表1 動物分組及造模方法統計表Table 1 Statistical table of animal grouping and modeling methods

1.2.2 檢測指標及處理

采血前12 h禁食不禁水,每周用眼眶取血方法,每只取血0.5 mL,然后37℃水浴30 min,3000 r/min離心15 min,取血清100μL。按照尿酸、肌酐和尿素氮試劑盒的說明書,采用紫外分光光度計和酶標儀測定大鼠血清中尿酸、肌酐和尿素氮的水平。

1.2.3 大鼠腎的病理組織學檢查

大鼠處死后,取全腎,稱重,計算腎體比。右腎用生理鹽水清洗后,浸泡在10%中性甲醛溶液中固定,然后進行常規脫水,石蠟包埋,HE染色。左腎浸泡在無水乙醇中固定,按照尿酸鹽染色方式進行染色,然后在400倍物鏡視野下,隨機選擇l0個無腎小球只有腎小管的視野,按照馮學軒等[10]的尿酸鹽結晶評分標準對腎小管尿酸鹽結晶情況進行半定量測定。利用BX63正置熒光顯微鏡拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠不同時間點體重變化

除C、D兩組外,其余各組大鼠的體重隨飼喂時間增加均呈緩慢增加的趨勢。與正常組相比,在第3周時,A和C組大鼠體重明顯降低(P<0.05,P<0.01);在第4周時,A和C組大鼠體重較正常組均極顯著降低(P<0.01);在第5周時,C和D組大鼠體重較正常組均極顯著降低(P<0.01),說明在不同時間點,A、C和D三種方法制造慢性高尿酸血癥腎損害模型均會降低大鼠的體重,而C種方法能穩定的降低大鼠的體重(見表2)。

表2 各組大鼠不同時間點體重的變化(g)Table 2 Changes of body weight of rats in each group at different time points(g)

2.2 各組大鼠雙腎重與體重的比值

單從雙腎重量比較,C組大鼠與其余各組并無區別,但C組大鼠雙腎重與體重的比值與正常組相比極顯著升高(P<0.01),其原因是由于C組大鼠體重降低引起的(見圖1)。

圖1 各組大鼠雙腎重與體重的比值Figure 1 Ratio of kidney weight to body weight of rats in each group

2.3 各組大鼠不同時間點血清中尿酸水平的變化

結果見表3。除正常組外,模型組各組大鼠的血清中尿酸水平隨飼喂時間增加均呈先上升后下降的趨勢。與正常組相比,在第1和2周時,A、B、C和D組大鼠血清中尿酸水平顯著升高(分別為P<0.05,P<0.01);在第3周時,C和D組大鼠血清中尿酸水平較正常組顯著升高(分別為P<0.05,P<0.01);在第4周時,C組大鼠血清中尿酸水平較正常組極顯著升高(P<0.01),在第5周時,C組大鼠血清中尿酸水平較正常組顯著升高(P<0.05)。說明在前1～2周時,模型組各組大鼠能顯著升高血清中尿酸水平,但隨著時間的延長,模型組各組大鼠血清中尿酸水平均會降低,只有C組在第5周時,仍和正常組具有統計學意義。

表3 各組大鼠不同時間點血清中尿酸水平的變化(μmol/L)Table 3 Changes of serum uric acid level in rats of each group at different time points(μmol/L)

2.4 各組大鼠不同時間點血清中尿素氮水平的變化

結果見表4。與正常組相比,在第1周和第2周時,C組大鼠血清中尿素氮水平顯著升高(P<0.05);在第3周時,B、C和D組大鼠血清中尿素氮水平較正常組極顯著升高(P<0.05);在第4和5周時,C組大鼠血清中尿素氮水平較正常組極顯著升高(P<0.05),說明C種方法制造的慢性高尿酸血癥腎損害模型會升高大鼠血清中的尿素氮水平,并隨著時間的延長保持穩定。

表4 各組大鼠不同時間點血清中尿素氮水平的變化(mmol/L)Table 4 Changes of serum urea nitrogen level in rats of each group at different time points(mmol/L)

2.5 各組大鼠不同時間點血清中肌酐水平的變化

結果見表5。與正常組相比,在第2周時,A和C組大鼠血清中肌酐水平顯著升高(分別為P<0.05,P<0.01);在第3周時,B和C組大鼠血清中肌酐水平較正常組極顯著升高(P<0.01);在第4和5周時,C和D組大鼠血清中肌酐水平較正常組極顯著升高(P<0.01),說明C和D種方法制造的慢性高尿酸血癥腎損害模型會升高大鼠血清中的肌酐水平,并隨著時間的延長保持穩定。

表5 各組大鼠不同時間點血清中肌酐水平的變化(μmol/L)Table 5 Changes of serum creatinine level in rats of each group at different time points(μmol/L)

2.6 各組大鼠形態觀察

結果見圖2。正常組大鼠腎顏色呈暗紅色,表面光滑,模型組各組大鼠腎顏色均發黃,以C和D組尤為明顯,且B、C和D組腎外觀表面呈細顆粒狀。對腎進行剖面觀察,發現正常組腎皮質呈紅褐色,腎髓質呈淡紅色,A組腎皮質呈淡紅色,腎髓質顏色較正常組更深;C組腎皮質呈淡黃色,腎髓質呈纖維狀。

圖2 各組大鼠腎及剖面形態Figure 2 Kidney and sectional morphology of rats in each group

2.7 各組大鼠組織病理學結果

結果見圖3。正常組大鼠腎小球大小正常,腎小管結構完整清晰。各模型組大鼠均可見腎損傷,表現為腎小管變性、擴張,部分腎小管有炎細胞浸潤,腎小球系膜增生。其中B和D組腎小管炎細胞浸潤較為嚴重,C組腎小管有炎細胞浸潤,腎小管普遍變性擴張。

圖3 各組大鼠腎HE染色病理切片Note.Black arrow.Renal tubular dilatation.Blue arrow.Inflammatory cell infiltration.Figure 3 Pathological sections of kidney in each group

2.8 各組大鼠腎小管尿酸鹽結晶情況

正常組和A組腎小管內未見尿酸鹽結晶沉積,B、C和D模型組均可見尿酸鹽結晶沉積。與正常組相比,B、C和D組的尿酸鹽結晶評分均極顯著升高(P<0.01)(見圖4)。

圖4 各組大鼠腎小管尿酸鹽結晶沉積情況Figure 4 Urate crystal deposition in renal tubules of rats in each group

3 討論

尿酸是嘌呤代謝的產物,在腎近端小管中受過濾、重吸收和分泌的影響。高尿酸對腎小球的損害機制是使腎小球靜水壓升高,進而導致腎小球肥大和硬化[11]。高尿酸所致腎小管損傷的機制之一是Na+-K+-ATP酶信號傳導的損傷,進而引發炎癥、自噬和線粒體功能障礙,導致腎小管細胞損傷[12]。同時,高尿酸可促進巨噬細胞產生活性氧(reactive oxygen species,ROS),上調雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、激活Caspase-1和促進白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)成熟或者分泌,從而導致腎小管上皮細胞脫離、腎小管間質炎癥和纖維化[13]。高血清尿酸水平使患者易于形成尿酸鹽結晶,而尿酸鹽結晶通過激活腎NF-κB和MAPK等信號通路觸發炎癥反應,誘導多種促纖維化和促炎性趨化因子的產生和釋放,導致氧化應激和腎近端小管細胞受損[14]。損傷后的近端小管細胞,在細胞周期的G2/M階段發生阻滯,促進促纖維化細胞因子的分泌,最終導致腎纖維化[15]?？傊?高尿酸血癥會導致腎小球和腎小管細胞損傷,最終導致腎纖維化。

在本實驗4種造模方案中,涉及了3種藥品,氧嗪酸鉀是尿酸酶抑制劑,能抑制嚙齒類動物的尿酸酶活性[16]。腺嘌呤是一種尿酸的前體,能轉化為黃嘌呤沉積在腎小管,同時導致自由基氧化和脂質的過度產生,進而導致腎損傷[17]。酵母浸膏增加大鼠的嘌呤攝入。因此,3種藥品可以通過增加尿酸來源,抑制尿酸酶活性來建立慢性高尿酸血癥腎損害模型。在本實驗的4種造模方案中,A和B兩種方法是通過飼喂制造慢性高尿酸血癥腎損害模型,此2種方法能短暫時間內升高大鼠血清尿酸、肌酐和尿素氮水平,但不能保持穩定。D種方法能升高造模后大鼠血清尿酸水平,并維持到第3周,同時升高大鼠血清肌酐水平(4～5周),但并不能使大鼠血清尿素氮水平的持續升高,病理切片和尿酸鹽結晶半定量分析顯示其腎的損傷也不如C組。綜合來說,通過飼喂的方式不如灌胃制造慢性高尿酸血癥腎損害模型的效果好,其原因可能是飼喂的方式并不能保證所有的飼料被大鼠吃掉,有可能啃食過程中造成浪費。

同樣用灌胃方法,還有文獻報道用150 mg/kg腺嘌呤聯合250 mg/kg乙胺丁醇持續21 d制造慢性高尿酸血癥模型,此模型中血清尿酸、肌酐、尿素氮均明顯升高,且出現腎尿酸鹽結晶沉積,大量腎小管變性、壞死,炎性細胞浸潤等病理改變,其腎的病理改變與本模型的結果類似[10]。但是乙胺丁醇會競爭性抑制腎小管分泌尿酸,導致腎受損,因此采用乙胺丁醇造模不符合高尿酸血癥腎損害的臨床發病機制[18]。

綜上所述,本實驗利用以100 mg/kg腺嘌呤聯合1500 mg/kg氧嗪酸鉀,早晚各灌胃1次的方式制造慢性高尿酸血癥腎損害模型,成模后大鼠體重減輕,雙腎重與體重的比值升高,血清尿酸、肌酐和尿素氮均持續升高,腎皮質呈淡黃色,腎髓質呈纖維化,病理檢測發現腎有一定程度的損傷。此方法無論從血生化還是病理組織學方面進行評價均有較好的成模型,該模型的建立為研究慢性高尿酸血癥腎損害的藥物篩選和開發有著極其重要的意義。