生防菌株BacillusvelezensisZ全基因組測序分析

高圣風 徐畢爽 陸大倩 劉愛勤 茍亞峰 孫世偉 王政 孟倩倩

摘 ?要：生防菌株Bacillus velezensis Z對胡椒瘟病等多種植物病害具有良好的生防效果;全基因組測序能夠為其分子機理研究和開發應用提供信息基礎。本研究開展該菌株全基因組測序，并進行比較基因組學和抑菌次生代謝產物合成基因簇預測研究。結果表明：B. velezensis Z菌株的基因組中含有1條4 054 780 bp大小的環形染色體DNA和1個17 122 bp大小的環形質粒，總基因組的GC含量為46.24%，共編碼基因4173個;包含27個rRNA，86個tRNA基因，34個sRNA;含有串聯重復序列179個，其中13個微衛星DNA，138個小衛星DNA;通過比較基因組學分析，結果發現該菌株與貝萊斯芽孢桿菌模式菌株FZB42同源性極高，與枯草芽孢桿菌模式菌株168之間具有一定的遺傳距離;同時發現B. velezensis Z基因組中共編碼次生代謝產物合成基因簇13個，其中8個與表面活性素（surfactin）、泛革素（fengycin）、溶桿菌素（bacilysin）、macrolactin H、bacillaene、difficidin、plantazolicin、amylocyclicin等已知基因簇完全相似或高度相似，其他5個基因簇皆功能未知?？傊?，本研究揭示了B. velezensis Z的全基因組遺傳信息，明確其與貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的比較基因組學關系，預測了抑菌產物合成編碼基因簇，為該生防菌株及其抑菌產物的機理研究和開發應用奠定基礎。

關鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌;全基因組測序;比較基因組學;次生代謝產物;抑菌

中圖分類號：S435.73 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Bio-control strain Bacillus velezensis Z shows good effects on the control of various diseases， especially good for the black pepper Phytophtora foot rot disease. The whole genome sequencing is an important basis to further study the molecular mechanism. In this study， the whole genome of the strain was completely sequenced using both Illumina HiSeq 4000 and PacBio RS II， and the gene function annotation， analyses of comparative genomics and secondary metabolite biosynthetic gene clusters were performed using blast alignment tools. The complete genome sequence of B. velezensis Z was consisted of a circular 4 054 780 bp chromosome and a 17 122 bp plasmid with GC content of 46.24%， 4173 identified genes， 27 rRNA， 86 tRNA， 34 sRNA， 179 tandem repeat regions including 138 minisatellite DNA and 13 microsatellite DNA. The genome showed highly homologous with the model strain B. velezensis Z FZB42 by the analyses of core/pan gene and gene family. B. velezensis Z harbored 13 secondary metabolite biosynthetic gene clusters， including 8 clusters involved in the synthesis of surfactin， plantazolicin， macrolactin H， bacilysin， fengycin， difficidin， amylocyclicin， bacillaene， and others functionally unknown. In conclusion， the genetic information， comparative genomics and antibiotics synthesis gene clusters of the B. velezensis Z were revealed in this study， and it would be useful for further research and utilization of the strain.

Keywords： Bacillus velezensis; whole genome sequencing; comparative genomics; secondary metabolite; antibiotic

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.003

根際促生細菌（plant growth-promoting rhi-zobacteria，PGPR）天然生存于植物根際，具有拮抗病原菌、促進植株生長、誘導植株抗病、修復根際環境等多種功效，是當前實施“減肥、減藥”的有效支撐手段[1-2]。芽孢桿菌（Bacillus spp.）具有廣普高效、容易培養、耐逆境、耐儲藏等特點，是國內外研究和應用最多的生防菌類群。次生代謝產物是芽孢桿菌發揮生防功效的重要手段。目前已發現芽孢桿菌能夠產生多種對植物有益的次生代謝產物，包括非核糖體途徑（non-ribosomal peptide synthesis，NRPS）合成的脂肽類化合物[3-4]、聚酮合酶合成途徑（polyketide synthase，PKS）合成的聚酮類化合物[5-7]，以及核糖體途徑（ribosomal peptide synthesis，RPS）合成的含噻唑（啉）線性肽類物質（linear azol（In）E-containing peptides，LAP）[8]、細菌素（bacteriocin）[9]、硫肽類物質（thiopeptide）[10]、萜烯類物質（terpene）[11]等。芽孢桿菌分泌的有益次生代謝產物種類繁多，全基因組測序是認識和利用生防菌株的重要基礎。

生防菌株B. velezensis Z由本研究室從胡椒葉片中分離獲得，在盆栽試驗中對胡椒瘟病的防效達83%[12]，具有良好的生防應用前景。該菌株曾被認為是枯草芽孢桿菌[13]。本研究對B. velezensis Z進行全基因組測序和精準鑒定，并基于全基因組序列開展比較基因組學分析及抑菌產物合成基因簇研究，為該生防菌株的后續研究和利用提供基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

生防菌株B. velezensis Z由本研究室從感染胡椒瘟病的胡椒葉片組織中分離獲得，保存于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心（China General Microbiological Culture Col-lection Center， CGMCC），菌株保藏編號為No. 4844。

1.2 ?方法

1.2.1 ?全基因組測序 ?生防菌株B. velezensis Z在LB培養基中于37 ℃ 200 r/min條件下培養12 h 后，1000?g離心收集菌體，提取基因組總DNA，DNA純度檢測合格后，委托深圳華大基因股份有限公司進行de novo測序分析。測序采用第三代PacBio平臺與第二代Illumina平臺相結合的測序技術，測序結果與COG（cluster of ortho?logous groups of proteins）、GO（gene ontology）等12個數據庫比對進行基因功能注釋[14]。

1.2.2 ?比較基因組學分析 ?從NCBI Genome上下載B.velezensis FZB42、B. subtilisW23、B. subtilis168等模式菌株的全基因組序列，與B. velezensis Z全基因組序列（包含質粒）一起進行以下比較基因組學分析。

（1）共有基因（Core Gene）和特有基因（Specific Gene）分析：參照Fu等[15]的方法，將生防菌B. velezensis Z的蛋白基因集與其他3個模式菌株的蛋白基因集一起采用CD-HIT 4.6.6軟件進行聚類分析，將聚類獲得的所有非冗余的基因集定為Pan Gene，提取聚類結果中4個菌株共有的基因集為Core Gene，單個菌株中特有的基因集為Specific Gene，Pan Gene中去除Core Gene為非共有基因集（Dispensable Gene）。根據各基因集在4個菌株基因組中的分布情況，繪制Dispensable Gene熱圖和Pan Gene文氏圖以展現菌株間的聚類情況。參照Tannistha等[16]的方法，將Core/Pan分析結果用TreeBeST 1.9.2軟件采用最大似然法（PHYML）計算，bootstraps參數設置為1 000次，構建系統進化樹。

（2）基因家族（Gene Family）分析：基于4個菌株的全部基因，對蛋白序列進行BLAST比對分析去除冗余，然后將非冗余結果進行TreeFam聚類處理，再將聚類的基因家族進行多序列比對后轉化成CDS區域的氨基酸多序列比對數據，最后用TreeBeST 1.9.2軟件采用NJ法構建系統發育樹[16-18]。

1.2.3 ?次生代謝產物合成基因簇分析 ?生防菌株B. velezensis Z的抑菌次生代謝產物合成基因簇分析方法與前人[14]報道相同，采用antiSMASH軟件（https：//antismash.secondarymetabolites.org/#！/ start）[19]在線預測。并結合NCBI BLAST比對分析結果，對預測的次級代謝產物合成基因簇進行分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?全基因組測序結果

測序結果分析發現，生防菌株B. velezensis Z含有1條4 054 780 bp大小的染色體和1個17 122 bp大小的質粒，總基因組的GC含量為46.24%，共編碼4173個基因，基因注釋率為98.39%;其中染色體的GC含量為46.27%，編碼基因4155個，含有27個rRNA、86個tRNA基因、34個sRNA;含有串聯重復序列177個，其中13個微衛星DNA，138個小衛星DNA。另外，質粒DNA的GC含量為39.84%，編碼基因18個，含有sRNA和串聯重復序列各2個。

基于COG數據庫注釋結果構建基因組圈圖（圖1）。在預測的4173個基因中，（1）遺傳信息類別：染色質結構與動力相關基因1個，RNA加工與修飾相關基因1個，核糖體結構、翻譯和生物合成相關基因231個，轉錄相關基因286個，復制、重組和修復相關基因128個;（2）細胞相關類別：細胞周期控制、染色體分離和細胞分裂相關基因61個，細胞膜、細胞外膜和細胞壁的合成相關基因209個，細胞骨架相關基因2個，細胞外結構相關基因2個，細胞內轉運、胞外分泌和小泡運輸相關基因36個，細胞運動相關基因64個，防御機制相關基因94個，信號轉導機制相關基因183個;（3）新陳代謝類別：翻譯后修飾、分子伴侶和蛋白轉運相關基因122個，可移動基因組序列（轉座子、原噬菌體）相關基因25個，能量產生與轉換相關基因177個，氨基酸轉運與代謝相關基因305個，碳水化合物轉運與代謝相關基因265個，脂類轉運與代謝相關基因151個，核苷酸轉運與代謝相關基因94個，輔酶轉運與代謝相關基因192個，無機離子轉運與代謝相關基因180個，次級代謝產物合成、轉運與代謝相關基因115個;未知（Poorly）類別：僅常規功能預測的基因335個，功能未知基因206個。

2.2 ?比較基因組學分析

2.2.1 ?基于4個菌株全基因組序列的Core/Pan分析 ?通過Core/Pan分析，發現B. velezensis Z與3個模式菌株的所有非冗余的Pan Gene數量為5651個，長度為1 578 662 bp;其中共有的Core Gene數量為2702個，長度為823 203 bp;非共有的Dispensable Gene數量為1347個，長度為45967 bp;各菌株特有Specific Gene數量分別為628個、436個、341個和197個。4個菌株中，以B. velezensis Z的Specific Gene數目最多，散布于基因組中，部分基因功能預測與外排轉運、核糖體、脂類轉運代謝、膜蛋白、DNA修飾、次生代謝產物等相關，大部分基因功能未知（圖2）。通過Dispensable Gene同源關系熱圖（圖2A）、Pan Gene同源關系文氏圖（圖2B）和Core Gene系統發育樹（圖2C）可看出，B. velezensis Z的基因組與貝萊斯芽孢桿菌模式菌株FZB42最為相似，與另外2株枯草芽孢桿菌模式菌株168具有明顯的遺傳距離。

2.2.2 ?基于4個菌株全基因組序列的Gene Family分析 ?通過Gene Family分析，發現B. velezensis Z、B. velezensis FZB42、B. subtilis 168、B. subtilis W23等4個菌株能夠聚類到Gene Family的基因數量分別為3685個、3907個、3706個和3565個，Gene Family數量分別為2710個、2816個、2715個和2601個;其中共有的Gene Family數量為2777個，各菌株特有的Gene Family數量分別為6個、11個、7個和3個（圖3A、圖3B）。通過Gene Family系統發育樹可看出，B. velezensis Z菌株與B. velezensis FZB42菌株聚類到同一分支，與另外2株枯草芽孢桿菌之間的遺傳距離約為0.20（圖3C）。

2.3 ?基于全基因組序列的次生代謝產物預測分析

通過antiSMASH在線預測和NCBI BLAST比對分析，結果發現B. velezensis Z菌株共編碼13個次生代謝產物合成基因簇，其中8個基因簇能夠找到完全相似或相似度極高的已鑒定基因簇，另有5個基因簇未能找到已鑒定基因簇（表1）。由表1可看出，B. velezensis Z菌株編碼的次生代謝產物有非核糖體途徑的表面活性素（surfactin）、溶桿菌素（bacilysin）和泛革素（fengycin）;聚酮合酶合成途徑的bacillaene、macrolactin和difficidin;以及核糖體途徑中Linear azol（in）e-containing peptides（LAP）類的plantazolicin和Bacteriocin類的amylocyclicin。在與已知基因簇比對結果中，表面活性素和Plantazolicin編碼基因簇的相似度分別為82%和91%，其他基因簇的相似度均為100%。此外，B. velezensis Z菌株還可能編碼5種未知的次生代謝產物，初步預測為2種聚酮類物質、2種萜烯類物質和1種硫肽類物質。在與其他菌株基因組比對結果中，僅有1個基因簇的相似度高達97%，其他基因簇均不高于70%。

3 ?討論

細菌de novo測序是其分子機理研究的重要工具，廣泛用于遺傳進化關系研究、功能相關基因鑒定、工程菌改造等領域，能夠為生防菌的分子機理研究及開發利用提供信息基礎。本研究對生防菌株B. velezensis Z進行de novo全基因組測序，雖然該菌株的基因組（包括質粒）大小僅有3.88 Mb，但其各種功能元件非常豐富，編碼基因長度占總基因組的88.71%。此外，B. velezensis Z中還攜帶一個大小為16.72 kb的質粒，共有22個ORF閱讀框，其中ORF2～ORF9等8個ORF閱讀框與ORF12～ORF19等閱讀框的同源性高達100%，每組ORF閱讀框中均編碼Rap（ORF5/ ORF15）和Rep蛋白（ORF7/ORF17），表明該質粒的功能可能與細菌群體感應的Rap–Phr雙組分調控系統相關[24]，為研究和利用生防菌株的群體感應提供了材料和基礎。

B. velezensis的種名和分類地位曾經歷多次定名、改名、分類地位失效等波折，直至2016年才正式確立[25-27]。之前，B. velezensis Z曾被鑒定為枯草芽孢桿菌[12]，2016年后被重新鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（結果未發表）。本研究基于全基因組序列開展比較基因組學分析，GeneFamily分析和Core/Pan分析結果均表明，B. velezensis Z與貝萊斯芽孢桿菌模式菌株FZB42同源性極高，與2株枯草芽孢桿菌模式菌株168和W23的遺傳距離均在0.16以上，再次證明該菌株是貝萊斯芽孢桿菌。

芽孢桿菌能夠分泌豐富多樣的次生代謝產物，是其發揮防病、促生長等對植物有益效果的重要前提。王曉宇等[22]發現B. subtilisBs-916菌株的全基因組中包含8個NRPS/PKS基因簇，可以合成fengycin、surfactin、bacillomycin L等物質，具有抑制細菌、真菌、形成生物膜、累積鐵離子等作用。Wu等[23]發現B. velezensis NAU-B3的基因組中包含bacillomycin D、bacilysin、bacillaene等8個功能已知的次生代謝產物編碼基因簇和1個功能未知基因簇，其長度占基因組總長度的8.5%，合成途徑涵蓋NPRS途徑、PKS途徑、PRS等途徑。本研究發現生防菌B. velezensis Z編碼的fengycin、bacilysin、macrolactin、bacillaene、difficidin、amylocyclicin等6種抑菌產物合成基因簇與已鑒定基因簇完全相同，surfactin和plantazolicin合成基因簇與已鑒定基因簇的相似度也高達82%和91%。這些次生代謝產物被報道具有拮抗植物病原細菌、真菌、病毒，誘導植株抗病性，積累鐵離子，生物膜形成等有益功效[3-11]，說明生防菌B. velezensis Z具有良好的應用價值。此外，從B. velezensis Z菌株的基因組中還預測出5種未知的次生代謝產物合成基因簇，為今后深度挖掘B. velezensis Z生防潛力和發現新型抑菌物質提供基礎。

參考文獻

[1] Cao Y， Pi H， Chandrangsu P， et al. Antagonism of two plant-growth promoting Bacillus velezensis isolates against Ralstonia solanacearum and Fusarium oxysporum[J]. Scien-tific Reports， 2018， 8（1）： 4360.

[2] Venance C M， Alvina H R， Ayaz F， et al. Volatile organic compounds of endophytic Bacillus spp. have biocontrol ac-tivity against Sclerotinia sclerotiorum[J]. Phytopathology， 2018， 108（12）： 1373-1385.

[3] Koumoutsi A， Chen X， Henne A， et al. Structural and func-tional characterization of gene clusters directing nonribo-somal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42[J]. Journal of Bacteriology， 2004， 186（4）： 1084-1096.

[4] Rajesh R， Shen B， Yu C， et al. Molecular and biochemical detection of fengycin- and bacillomycin D-producing Bacil-lus， spp. antagonistic to fungal pathogens of canola and wheat[J]. Canadian Journal of Microbiology， 2007， 53（7）： 901-911.

[5] Schneider K， Chen X， Vater J， et al. Macrolactin is the poly-ketide biosynthesis product of the pks2 cluster of Bacillus amyloliquefaciens FZB42[J]. Journal of Natural Products， 2007， 70（9）： 1417-1423.

[6] Moldenhauer J， Daniel C D， Albert C， et al. The final steps of bacillaene biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens FZB42： direct evidence for beta， gamma dehydration by a trans-acyltransferase polyketide synthase[J]. Angewandte Chemie International edtion. in English， 2010， 49（8）： 1465-1477.

[7] Wu L M， Wu H J， Chen L N， et al. Difficidin and bacilysin from Bacillus amyloliquefaciens FZB42 have antibacterial activity against Xanthomonas oryzae rice pathogens[J]. Scientific Reports， 2015， 5（1）： 463-471.

[8] Scholz R， Molohon K J， Nachtigall J， et al. Plantazolicin， a novel microcin B17 streptolysin S-like natural product from Bacillus amyloliquefaciens FZB42[J]. Journal of Bacteriology， 2011， 193（1）： 215-224.

[9] Scholz R ， Vater J ， Budiharjo A ， et al. Amylocyclicin， a novel circular bacteriocin produced by Bacillus amylolique-faciens FZB42[J]. Journal of Bacteriology， 2014， 196（10）： 1842-1852.

[10] Roessler C， Arndt H D. A master switch in thiopeptide biosynthesis[J]. Cell Chemical Biology， 2018， 25（2）： 121-123.

[11] Sato T ， Yamaga H， Kashima S， et al. Identification of novel sesterterpene/triterpene synthase from Bacillus clausii[J]. Chembiochem Communications， 2013， 14（7）： 822-825.

[12] 桑利偉， 劉愛勤， 高圣風， 等. 防治胡椒瘟病生物農藥篩選及其盆栽藥效試驗[J]. 熱帶作物學報， 2017， 38（5）： 915-918.

[13] 桑利偉， 劉愛勤， 譚樂和， 等. 一種內生枯草芽孢桿菌： CN102250816A[P]. 2011-11-23.

[14] 高圣風， 劉愛勤， 桑利偉， 等. 胡椒瘟病生防菌Bacillus subtilis VD18R19全基因組測序及比較基因組學分析[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（10）： 2021-2027.

[15] Fu L M， Niu B F， Zhu Z W， et al. CD-HIT： accelerated for clustering the next-generation sequencing data[J]. Bioinfor-matics， 2012， 28（23）： 3150-3152.

[16] Tannistha N， Catherine O， Arvind P S， et al. A genomic survey of positive selection in Burkholderia pseudomallei provides insights into the evolution of accidental virulence[J]. PLoS Pathogens， 2010， 6（4）： 1-15.

[17] Edgar R C. MUSCLE： multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[J]. Nucleic Acids Re-search. 2004， 32（5）： 1792-1797.

[18] Edgar R C. MUSCLE： a multiple sequence alignment me-thod with reduced time and space complexity[J]. BMC Bio-informatics， 2004， 5（1）： 113.

[19] Kai B， Simon S， Katharina S， et al. antiSMASH 5.0： updates to the secondary metabolite genome mining pipeline[J]. Nucleic Acids Research， 2019， 47（W1）： 81-87.

[20] Jung J Y， Chun B H， Moon J Y， et al. Complete genome sequence of Bacillus methylotrophicus JJ-D34 isolated from deonjang， a Korean traditional fermented soybean paste[J]. Journal of Biotechnology， 2016， 219： 36-37.

[21] Qin Y， Han Y， Yu Y， et al. Complete genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens L-S60， a plant growth-promoting and antifungal bacterium[J]. Journal of Biotechnology， 2015， 212： 67-68.

[22] 王曉宇， 羅楚平， 陳志誼， 等. 枯草芽胞桿菌Bs-916的全基因組分析[J]. 中國農業科學， 2011， 44（23）： 4807-4814.

[23] Wu H， Qiao J， Blom J， et al. The rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum NAU-B3 contains a large inversion within the central portion of the genome[J]. Genome Announcements， 2013， 1（6）： e00941.

[24] Qiao J， Tian D， Huo R， et al. Functional analysis and appli-cation of the cryptic plasmid pBSG3 harboring the RapQ–PhrQ system in Bacillus amyloliquefaciens B3[J]. Plasmid， 2010， 65（2）： 141-149.

[25] Wang L， Lee F， Tai C， et al. Bacillus velezensis is a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens[J]. In-ternational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2008， 58（3）： 671-675.

[26] Dunlap C A， Kim S J， Kwon S W， et al. Phylogenomic anal-ysis shows that Bacillus amyloliquefaciens subsp. plan-tarum is a later heterotypic synonym of Bacillus methylotrophicus[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2015， 65（7）： 2104-2109.

[27] Dunlap C A， Kim S J， Kwon S W， et al. Bacillus velezensis is not a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefa-ciens; Bacillus methylotrophicus， Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum and ‘Bacillus oryzicola are later hetero-typic synonyms of Bacillus velezensis based on phyloge-nomics[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2016， 66（3）： 1212-1217.

責任編輯：黃東杰