8個玉米ZmDOFs基因對非生物脅迫響應的表達分析

賈利強 趙秋芳 陳曙

摘 ?要：轉錄因子家族是由含有鋅指結構的DOF結構域組成，構成植物特有的轉錄因子家族之一，在植物的生長發育進程中諸如信號轉導、形態建成、抵御環境脅迫等方面都發揮著重要的作用。本研究利用定量PCR技術，探測了8個ZmDOFs基因在玉米6個不同組織的表達模式，結果表明，8個ZmDOFs基因具有不同的組織特異性表達模式，4個主要在幼穗中表達，2個主要在雄花中表達，ZmDOF28主要在苞葉中表達，而ZmDOF38在多種組織中表達，表明在玉米進化的進程中8個ZmDOFs基因表達模式的保守性和特異性。鹽脅迫和干旱脅迫時，分別有7個和6個ZmDOFs基因受到明顯的誘導，表明ZmDOFs基因廣泛參與玉米應答鹽脅迫或干旱脅迫響應途徑。在銨態氮脅迫和硝態氮脅迫時，分別有7個和8個ZmDOFs基因的表達受到了明顯的改變，表明ZmDOFs基因參與玉米應答氮脅迫響應途徑，體現了在其歷史進化進程中的表達模式和功能的保守性與獨特性。本研究為后續研究ZmDOFs基因的功能提供了參考。

關鍵詞：DOF轉錄因子;進化樹;組織表達;非生物脅迫

中圖分類號：S513 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： The DNA-binding one finger （DOF） transcription factor family is a major family of plant-specific transcrip-tion factors containing the DOF domain. These transcription factors are involved in a variety of functions of importance for different biological processes in plants. In the current study， an overview of 8 DOFs genes in maize is presented， including the gene structure， chromosome location， phylogeny， proten motif and expression pattern in responses to various abiotic stresses. Expression patterns indicated that the eight ZmDOFs had tissue specific expression patterns， indicating these genes are crucial in maize growth and development. Moreover， we examined the transcriptional levels of the eight ZmDOFs under salt and PEG6000 stress treatments， seven ZmDOFs and six ZmDOFs were up-regulated after salt and PEG6000 treatment， respectively. We also analyzed the eight ZmDOFs profilling under ammonium and nitrate stress treatment， seven and eight ZmDOFs significantly responded to these two stresses， indicating they are associated with nitrogen stresses responses. The results would provide a very useful reference for the cloning and functional analysis of the members of this gene family in maize and other species.

Keywords： DOF transcription factor; phylogenetic tree; tissue expression; abiotic stress

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.006

DOF蛋白是含有保守的DOF結構域的一類植物特有的轉錄因子。其保守的結構域一般位于DOF蛋白的N端，由保守的52個氨基酸組成的含有C2-C2鋅指結構的元件組成，能特異性地結合下游基因啟動子區域的保守元件5-T/AAAG-3來調控下游基因的表達[1]。DOF蛋白的C端一般有高度不保守具有調控基因表達的氨基酸序列組成[2]。第一個報道的DOF基因來自于玉米[3]，第一個報道DOFs基因家族的植物是擬南芥[4]。之后，植物DOFs基因家族在許多植物包括低等植物藻類或苔蘚中開展了研究[5]。相比較而言，高等植物編碼的DOFs基因數目增多。已報道的有擬南芥（36個）和水稻（30個）[4]、大麥（26個）[5]、小麥（96個）[6]、短柄草（27個）[7]、番茄（34個）[8]、大豆（28個）[9]、甘蔗（25個）[10]、白菜（76個）[11]、玉米（46個）[12]、馬鈴薯（35個）[13]，西瓜（36個）[14]，以及堅果（25個）和蓖麻（24個）[15]。植物DOFs基因家族的廣泛研究為后續揭示DOFs基因的功能提供了基礎信息。

植物DOFs基因家族參與調控植物生長發育的諸多進程，包括種子萌發和成熟、激素響應等[16]。玉米的DOF1和DOF2通過調控磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、谷氨酰胺合成酶（AS）以及谷氨酸合成酶等活性來參與碳氮代謝調控[17-18]。進化樹分析結果顯示，植物DOF蛋白主要分成4個亞家族（A、B、C、D）[4]。D亞家族中的植物DOF蛋白作為細胞周期調控因子，通過節律性地調控CONSTANS（CO）和FLOW?E-RING LOCUS T（FT）基因的表達來影響光周期誘導的植物開花[19]。一些研究表明，番茄的CDFs蛋白作為轉錄調控因子還有其他的一些功能。在擬南芥中超表達番茄SICDF1和SICDF3會提高擬南芥的抗旱和抗鹽脅迫的能力[20]。另外在擬南芥中超表達SICDF3會延遲開花，表明CDFs蛋白在植物的抗逆性以及光周期誘導的植物開花等方面發揮著重要的作用。擬南芥的CDF3基因會被干旱、鹽、高低溫以及激素ABA等逆境脅迫誘導，超表達CDF3能提高植物的抗逆性[21]。這些研究結果增進了對DOFs基因在植物中的生物學功能的認識。

玉米是糧、經、飼綜合利用為一體的高效益大田作物，對于保障我國糧食安全起著重要作用。玉米生長周期內經常遭受各種逆境脅迫，諸如干旱脅迫、鹽脅迫以及氮脅迫的影響，玉米產量不穩定，常遭受重大損失，嚴重影響玉米產業的可持續發展和糧食安全。因此研究玉米抵御各類逆境脅迫的分子生理機制顯得尤為迫切。本研究系統地研究了8個ZmDOFs基因應答200 mmol/L NaCl、20% PEG6000脅迫以及氨態氮/硝態氮脅迫的響應表達模式，為后續進一步深入研究ZmDOFs的生物學功能提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗材料為玉米自交系B73?？俁NA提取采用Trizol試劑（Invitrogen， Carlsbad， CA， USA）。利用NanoDrop2000（Thermo?Scientific， Massa-chusetts， USA）進行RNA濃度與純度測定。殘留的核酸用DNase I（TaKaRa， Tokyo， Japan）除去。cDNA第一鏈的合成用PrimeScriptTM RT試劑盒（TaKaRa）。獲得的cDNA進行后續的熒光定量PCR（Light Cycler 480 System， Roche， Basel， Switzerland）。熒光染料用SYBR Premix Ex TaqTM kit （Roche， Mannheim， Germany）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?處理方法 ?為了探測8個ZmDOFs基因在玉米不同組織器官的表達模式，玉米B73自交系種植于中國熱帶農業科學院玉米育種基地（廣東湛江），生長至揚花授粉期，分別采集玉米的根系、莖、葉、雄花、授粉2周的幼穗和苞葉等組織器官，立即進行液氮冷凍處理保存。對于脅迫試驗，玉米B73種子經過5%次氯酸鈉溶液表面消毒5 min，放于浸潤的濾紙上在黑暗28 ℃下催芽，挑選出芽一致的種子在Holland營養液中置于生長箱中生長至3葉期，生長箱設定條件為長日照（16 h光照，28 ℃;8 h黑暗，25 ℃），然后進行各種脅迫處理。正常營養液中生長至15 d后選擇生長整齊一致的玉米3葉期幼苗分別轉移至200 mmol/L NaCl溶液中進行鹽脅迫處理，轉移至20% PEG6000溶液中模擬干旱脅迫處理，轉移至硝態氮或銨態氮缺乏的營養液中進行不同氮形態缺乏脅迫處理，分別在脅迫處理0、1、6、24 h后取葉片，快速液氮保存，備用。

1.2.2 ?RNA的提取及定量PCR分析 ?取0.1 g嫩葉組織，用Trizol試劑對總RNA進行提取。逆轉錄獲得cDNA，進行后續的熒光定量分析。擴增體系為10 μL體系：1 μL cDNA、上下游引物各1 μL、SYBR反應MIX為5、2 μL水。設定的PCR程序為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s;60 ℃ 20 s;72 ℃ 10 s;共循環45個。玉米Actin 1（GRMZM?2?G?126010）用作內參。用于進行定量分析8個基因的引物序列見表1。反應結束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線，并采用2?CT算法計算基因的相對表達量[22]。

1.2.3 ?8個ZmDOFs的生物信息學分析 ?36個擬南芥DOFs和8個玉米DOFs的蛋白和核酸序列從TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）和Phyt?oz?o???me（https：//jgi.doe.gov/data-and-tools/phytozome/）數據庫下載。利用Pfam和SMART（http：//smart. embl-heidelberg.de/）檢測候選蛋白結構域，獲得擬南芥和玉米的DOF蛋白序列。利用ProtParam （http：//expasy.org/tools）在線工具對8個ZmDOFs蛋白進行理化性質分析。使用在線軟件MAFFT（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/software/）進行多序列比對。利用在線軟件MEME（http：//meme- suite.org/tools/meme）對ZmDOFs保守基序元件進行分析。利用軟件MEGA 7（http：//www.ma-gasoftware.net/）中的NJ（neighbor-joining）法對DOF蛋白進行進化樹分析，構建系統發育進化樹。進化樹分析參數設定為p-distance方法，bootstrap值設定為1000，其他選項采用默認設置。根據這8個ZmDOF基因在玉米染色體上的位置，利用Mapinspect繪制其在染色體上的分布（http：// www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-mapinspect.html）。下載8個ZmDOFs基因的CDS和基因組序列，利用在線軟件GSDS 2.0（http：//gsds.cbi. pku.edu.cn）進行內含子-外顯子基因結構分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?8個ZmDOFs的生物信息學分析

8個ZmDOFs分布于5條染色體上，其中Chr1有3個ZmDOFs，Chr5有2個，Chr 2、Chr 3和Chr 7上各含有1個（圖1A）。8個ZmDOFs氨基酸數目為231～379，對應的Mw值為23.66～ 39.03 kDa。pI值為7.63～10.4。8個基因的基本信息見表2。為了更好地理解8個ZmDOFs的結構特征，利用在線軟件GSDS 2.0，用基因組序列和cDNA序列進行比對，繪制基因的外顯子和內含子的位置，結果顯示3個ZmDOFs含有1個內含子，而其他5個ZmDOFs沒有內含子（圖1B），表明這5個基因可能是通過轉座機制獲得的新基因。ZmDOF8和ZmDOF30以及ZmDOF10和ZmDOF28由片段復制機制形成（圖1C）。8個ZmDOFs和擬南芥36個AtDOFs構成的蛋白序列數據矩陣進行進化樹分析，結果表明（圖1D），8個ZmDOFs分布于3個亞家族Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅲ。其中Group Ⅰ中有4個ZmDOFs，而另2個亞家族各含有2個ZmDOFs，說明各家族內發生了不同的基因擴增或缺失進化歷程。

2.2 ?8個ZmDOFs的結構域分析

為了探測8個ZmDOFs功能蛋白基序的分布情況，利用在線軟件MEME預測了功能基序的分布，鑒定了6個Motifs（圖2A）。6個Motifs在8個基因中的分布情況見圖2B。Motif1存在于所有8個ZmDOFs蛋白的N端，是構成DOF結構域的核心蛋白基序。其他的基序分布于部分ZmDOFs蛋白中。位于同一家族的ZmDOF 蛋白具有類似的基序分布模式，例如ZmDOF8和ZmDOF30都只有保守的Motif1，Group Ⅲ中的ZmDOF10和ZmDOF28都含有Motif1、Motif3、Motif5和Motif6 四個基序。不同蛋白家族中含有不同的基序分布模式預示著在ZmDOF進化歷程中功能分化的來源。

2.3 ?8個ZmDOFs的組織特異表達分析

為了檢測8個ZmDOFs在玉米不同組織器官中的表達模式，為揭示其生物學功能提供信息，利用定量PCR技術探測了在玉米根（R）、莖（S）、葉（L）、花（F）、授粉15 d的小穗（E）和苞葉（CB）等不同組織的表達模式（圖3）。8個ZmDOFs具有明顯的組織特異性表達模式。其中4個ZmDOFs（ZmDOF6、ZmDOF8、ZmDOF10和ZmDOF15）主要在授粉15 d的幼穗中表達，呈現明顯的組織特異性表達模式。ZmDOF6、ZmDOF8、ZmDOF10和ZmDOF15在幼穗中的表達豐度分別是根部的87 278、113、42、7倍，表明這4個基因在幼穗的生長發育進程中發揮著重要的作用。ZmDOF16和ZmDOF30主要在雄花中表達，其表達豐度分別是根部的342倍和34倍。ZmDOF28主要在苞葉中表達，其豐度是根部的27倍。ZmDOF38呈組成性表達模式。結果表明，8個ZmDOFs在玉米幼穗、雄花和苞葉的生長發育進程中發揮著重要的作用，也表明在其進化歷程中，8個ZmDOFs的表達模式和蛋白功能具有保守性和分化性。

2.4 ?8個ZmDOFs對鹽和干旱脅迫的響應模式

為了研究8個ZmDOFs在玉米應答鹽和干旱等脅迫時的響應表達模式，用200 mmol/L NaCl和20% PEG6000分別模擬鹽脅迫和干旱脅迫，分別在處理玉米3葉期幼苗0、1、6、24 h時，取樣并利用定量PCR技術檢測了8個ZmDOFs的響應表達模式（圖4）。在鹽脅迫條件下，ZmDOF15沒有發生明顯的變化，其余7個ZmDOFs的表達在脅迫處理的1 h發生明顯的誘導增強，其中ZmDOF10表現最為明顯，其表達豐度增加了45倍，其他的增加幅度在2～4倍之間，表明這些基因為鹽脅迫早期響應基因，在抵御鹽脅迫的響應途徑中發揮作用。在整個鹽脅迫進程中，ZmDOF6的表達逐漸增強，在24 h時達到高峰，預示著ZmDOF6在參與玉米應答鹽脅迫的響應途徑中所發揮的生物學功能與其他的ZmDOFs有異。在干旱脅迫處理時，ZmDOF6和ZmDOF28沒有發生明顯的變化，表明這2個基因可能不參與干旱脅迫途徑。其他6個ZmDOFs基因在干旱脅迫處理1 h時發生了明顯的誘導，ZMDOF16的表達水平提高了46倍，并且一直維持到脅迫處理結束，表明這些基因是干旱脅迫早期響應基因，參與應答干旱脅迫響應途徑。

2.5 ?8個ZmDOFs對銨態氮和硝態氮脅迫的響應模式

由圖5可知，在氨態氮脅迫處理1 h時，有4個基因（ZmDOF8、ZmDOF10、ZmDOF16和ZmDOF30）受到氨態氮脅迫的明顯誘導，其中ZmDOF16的表達增強10倍以上，并且一直持續到試驗結束，表明這4個基因是參與玉米應答氨態氮脅迫時的早期響應基因，在早期參與調控玉米應答銨態氮脅迫途徑。有3個基因（ZmDOF6、ZmDOF15和ZmDOF38）在脅迫處理的后期才出現明顯的誘導，表明這3個基因為晚期響應基因。而ZmDOF28的表達在整個脅迫處理過程中沒有出現明顯的變化，表明該基因可能不參與氨態氮脅迫響應途徑。研究表明，8個ZmDOFs基因廣泛地參與調控玉米應答氨態氮脅迫的響應途徑，同時在其進化歷程中表現出不同的表達模式，在調控氨態氮脅迫途徑上功能多樣。硝態氮脅迫處理時，8個ZmDOFs的表達模式可分為2大類。有4個基因（ZmDOF6、ZmDOF15、ZmDOF28和ZmDOF38）從脅迫處理開始時一直下調，在脅迫試驗結束時下調了至少10倍，表明這4個基因在硝態氮脅迫響應途徑中可能起負調控作用。另外4個基因（ZmDOF8、ZmDOF10、ZmDOF16和ZmDOF30）在處理1 h時表達明顯上調，例如ZmDOF8、ZmDOF16和ZmDOF30分別上調了34、42、43.5倍，之后其表達逐漸下降，到試驗結束時，其表達受到抑制，例如ZmDOF10在24 h的表達豐度只有處理前的5%。研究表明，8個ZmDOFs都參與了調控硝態氮脅迫響應途徑，并且發揮著不同的作用。

3 ?討論

進化樹蛋白家族成員起源相同，在蛋白序列、基因結構和功能基序上高度相似，同時在表達模式和蛋白功能上往往體現了保守中的多樣性。Group Ⅰ中有4個基因，其中ZmDOF8和ZmDOF30聚合在一起，ZmDOF15和ZmDOF38聚合在一起。ZmDOF8和ZmDOF30的表達模式都具有高度的組織特異性，體現了基因的保守性，前者主要在幼穗中表達，而后者主要在苞葉中表達，表達模式出現了分化，體現了基因的特異性。這一特點在Group Ⅱ和Group Ⅲ中也有體現，說明ZmDOFs在進化進程中的保守性和特異性（或者說分化）的統一。這一特點在不同物種間表現得更加明顯。Group Ⅱ家族中的成員ZmDOF6和ZmDOF16都是特異表達基因，體現了基因進化的保守性，前者在幼穗中表達，而后者在雄花中表達，表達模式出現了分化。同一家族成員擬南芥At1G28310調控細胞分裂周期，主要是在分生組織部位表達[23]。Group Ⅲ有3個成員（ZmDOF10、ZmDOF28和At5G65590），ZmDOF10和ZmDOF28表達具有組織特異性，而擬南芥At5G65590主要參與調控氣孔形態建成，其表達主要集中在葉片中[24]。這些數據表明在進化歷程中，這些基因的表達模式都出現了分化，可以預測其蛋白功能也發生了分化。亞家族Group Ⅰ中的ZmDOF10和ZmDOF30，Group Ⅲ中的ZmDOF8和ZmDOF30分別位于玉米染色體的同源序列區域，表明這2對基因是通過片段復制形成[25-26]。

近年來，許多研究表明植物DOFs基因家族參與調控植物的抗逆性。逆境脅迫會改變植物DOFs的表達模式，表明植物DOFs在植物抗逆性中的作用。辣椒DOFs應答不同逆境脅迫時呈現不同的表達模式[27]。香蕉DOFs對鹽和干旱脅迫的表達模式有異，在整個脅迫處理期間，大部分受到鹽和干旱脅迫的抑制，只有MaDOF23和MaDOF52受到誘導上調[28]。SICDFs同時受到鹽和PEG6000的強烈誘導，特別是SICDF2和SICDF4在脅迫處理24 h時達到最高峰[20]。SICDF3同時受到鹽、干旱或者溫度脅迫的強烈誘導，似乎SICDF3受逆境脅迫的誘導具有普遍性，而與受脅迫的類型無關[21]。Chen等[12]研究結果表明，ZmDOF16受到鹽脅迫的強烈誘導，比對照上調了25倍，而對干旱脅迫不敏感，ZmDOF6同時受到鹽脅迫和PEG6000脅迫的強烈誘導。而在本研究中，ZmDOF16受鹽脅迫上調了3.88倍，受PEG6000脅迫誘導上調了接近50倍，而ZmDOF6只受到鹽脅迫的強烈誘導，上調了近30倍，對PEG6000脅迫響應不敏感。這2種結果的差異可能是由于試驗方法的差異，本研究中用的是三葉期的玉米幼苗，而前人的研究中沒有說明試驗材料的苗齡，另一方面前人的干旱脅迫試驗用的是水培玉米苗離體自然干旱，本研究的是PEG6000模擬干旱，以及NaCl的濃度差異和取樣時間的差異等。

氮素是植物生長發育必需元素之一，闡述植物氮高效吸收利用的分子生理調控機制是選育資源友好型新品種的基礎工作。近年來，一些研究表明DOFs參與調控植物碳氮代謝平衡[29]。ZmDOF1可以促進擬南芥、馬鈴薯或水稻對土壤中氮素的吸收[17-18]。小麥TaDOF1的超量表達可促進谷氨酰胺合成酶和谷氨酸酶的表達，進而影響了小麥的氮利用效率[30]。水稻OsDOF18通過影響氨氮的運輸和氮的分布，進而影響植物對氮素的使用效率[29]。番茄CDF3過量表達會促進氮同化進程[20]。這些基因的表達模式也同時受到氮脅迫的改變。茶樹CDF1受到氮饑餓的明顯誘導[31]。水稻DOF18受到銨態氮脅迫的誘導，而受到硝態氮的抑制，表現出相反的作用[20]。小麥DOF1也受到氮脅迫的明顯誘導。本研究結果和前人的大多一致，例如8個ZmDOFs對銨態氮脅迫大部分受到明顯的誘導，而一部分ZmDOFs的表達受到硝態氮脅迫的抑制，表明玉米DOFs應答不同氮形態脅迫時的保守性和多樣性，提示ZmDOFs廣泛地參與調控玉米氮素代謝平衡并發揮著各自獨特的作用。

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責任編輯：謝龍蓮