石墨烯對大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移的影響和機制探索研究

彭雪霞, 魏 飛, 王麗芳, 董輝偉, 譚 蓉, 程春燕, 楊 棟*, 李君文*

(濱州醫學院公共衛生與管理學院， 山東煙臺 264000)

抗生素主要是由細菌、霉菌或其他微生物產生的次級代謝產物或人工合成的類似物，能夠抑制微生物的生長甚至將它們殺死，在防治細菌性疾病方面，抗生素發揮了至關重要的作用，人類在醫療、食品、農業等方面頗有受益〔1-3〕?，F如今抗生素已成為全球已成為當前最常用的藥物，隨著抗生素在臨床上的引入和濫用〔4〕，在抗生素選擇壓力下不可避免地會產生耐藥性，人類也在不斷地尋求新的抗菌藥物〔5〕。目前研究發現臨床、飲用水、廢水、土壤等環境中均存在著大量的耐藥菌和耐藥基因〔6-10〕，更加表明抗生素的濫用引發的抗生素耐藥問題日趨嚴重。 至今為止，研究發現細菌間發生基因水平轉移的主要方式有 3 種，環境中最常見的方式為接合轉移〔11〕。目前認為土壤、污水、生活垃圾和醫院垃圾混合的污水處理廠是耐藥基因傳播的重要場所〔12〕。納米材料作為一種可能的環境污染物質，其安全問題受到全世界的廣泛關注〔13〕，且目前研究發現納米材料能促進環境中耐藥基因進行水平轉移〔14〕。石墨烯是一種具有獨特的二維碳原子單層納米結構的材料,有優異的導熱性、導電性以及吸附性而被廣泛應用〔15-16〕，且隨著石墨烯的大量生產和使用，特別是應用于基礎設施建設環境中，將會導致其大量殘留，可能對環境中耐藥基因的擴散產生影響。本研究以大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌為研究對象，在一定條件下探討石墨烯對耐藥基因水平轉移的影響及規律。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1菌株 研究中采用的菌株為帶有RP4質粒的大腸埃希菌E.coli MG1655，是目前研究結合轉移常見的供體菌之一，該菌株攜帶卡那霉素、氨芐青霉素和四環素抗性基因。研究中的受體菌是具有美羅培南抗性基因的肺炎克雷伯桿菌，實驗室保存。

1.1.2石墨烯及相應濃度貯備液的配置 石墨烯G835836購自麥克林試劑網，純度≥99%。用電子分析天平(型號：AE2460S)分別稱取0.2 g、0.1 g、0.05 g、0.025 g、0.0125 g、0.006 g、0.002 g石墨烯，每份均加入高壓好的PBS(磷酸鹽緩沖液)10 ml震蕩搖勻，使之濃度分別達到20 mg/ml、10 mg/ml、5 mg/ml、2.5 mg/ml、1.25 mg/ml、0.6 mg/ml、0.2 mg/ml，常溫放置備用。

1.1.3培養基 (1)LB培養基：LB肉湯Miller，購自美國BD公司。用分析天平準確稱取25 gLB肉湯粉末，加無菌蒸餾水定容至1 L，高壓121 ℃滅菌20 min后冷卻備用。 (2)LB瓊脂培養基：LB肉湯Miller(美國BD公司)、瓊脂粉15 g(北京索萊寶科技有限公司)，加蒸餾水定容至1 L，高壓121 ℃、20 min滅菌后放入電熱鼓風干燥箱55 ℃備用。使用前煮沸，待冷卻至50 ℃左右加入抗生素混勻后使用。

1.1.4抗生素 實驗所用鹽酸四環素溶液50 mg/ml采自生工生物工程上海有限股份有限公司，美羅培南三水標準品采自北京索萊寶科技有限公司。配制美羅培南三水標準品溶液，用電子分析天平(型號：AE2460S)標準稱取0.05 g美羅培南加入10 ml無菌蒸餾水溶解，使之溶度達到5 mg/ml。四環素和美羅培南均用 0.22 μm 微孔濾膜過濾后分裝，凍存于-20 ℃冰箱備用。

1.1.5試劑及實驗器材 (1)試劑：PBS磷酸鹽緩沖液(PH7.2-7.4)，購自北京索萊寶科技有限公司。取緩沖液一包，加入2 L無菌蒸餾水溶解，高壓121 ℃滅菌20 min 后冷卻備用。 (2)實驗器材：15 ml離心管、10 ml離心管、30 ml離心管、1 L及2 L圓椎瓶、培養皿、離心機(ΜNIVERSAL)、微型漩渦混合儀(XW-80A)、臺式恒溫震蕩器(QE-1)等。

1.2 液相接合將大腸埃希菌接種于含有40 μg/ml四環素LB培養基中，同時肺炎克雷伯桿菌接種于含有2 μg/ml美羅培南的LB培養基中，在37 ℃下150 r/min振蕩過夜培養16 h后，在6000 r/min下離心5 min，棄去上清后用滅菌的PBS溶液離心洗滌菌液2次，用PBS重懸菌液后測定OD 600，根據OD值調整菌液至特定密度后備用，并立即進行后續實驗。

1.2.1石墨烯濃度對大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移的影響 均取等體積、等密度的供體菌和受體菌各4.75 ml 菌液1∶1混合均勻，在各制備好的懸液中加入石墨烯懸液0.5 ml(處理組)、PBS磷酸緩沖液0.5 ml(對照組)，使體系中石墨烯終濃度分別為0 μg/ml、1000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml、62.5 μg/ml、30 μg/ml、10 μg/ml，各體系震蕩搖勻，在37 ℃電熱恒溫培養箱中培養8 h，其中每隔2 h震蕩搖勻一次。作用8 h后后取出進行接合子篩選。

1.2.2初始菌濃度對石墨烯對大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移的影響 取9.5 ml初始菌密度分別為109、108、107、106的混合(1∶1)菌液各4份，向其中3份(設置3個平行)中加入0.5 ml濃度為10 mg/ml的石墨烯貯備液使其終濃度達到500 μg/ml，另外1份中加入0.5 mlPBS作為空白對照。將所有接合菌液混勻后，迅速放置到37 ℃的電熱恒溫培養箱中進行接合，接合8h后取出進行接合子篩選。

1.3 接合子的篩選水平接合轉移結束后將菌液按梯度稀釋后傾注在雙抗LB培養基選擇平板上，放于37 ℃電熱恒溫培養箱中培養36 h后計算接合子數，并計算耐藥基因水平轉移率。 為檢驗選擇培養基平板上篩選的耐藥細菌均為接合子，排除大腸埃希菌或肺炎克雷伯桿菌自發突變子的干擾，每次實驗在設立上述組別的同時還分別設立單獨大腸埃希菌對照組和 單獨肺炎克雷伯桿菌對照組，處理及篩選方法與接合組相同。

1.4 接合子驗證每項實驗均在雙抗選擇培養基平板上隨機挑取3個單個接合子菌落，培養在含有40 μg/ml四環素和2 μg/ml美羅培南的LB培養基中，放于臺式恒溫震蕩器中37 ℃、150 r/min振蕩培養過夜，觀察接合子生長情況。

1.6 統計方法處理采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行方差分析或非參數秩和檢驗，有顯著性差異后使用Dunnett檢驗比較實驗組和對照組的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 石墨烯濃度對大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移的影響石墨烯(濃度范圍10 μg/ml-1000 μg/ml)對大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移的影響(如圖1所示)?？瞻讓φ战M的接合轉移頻率約為2×10-5，濃度為10 μg/ml的石墨烯與空白對照無顯著差異。加入濃度分別1000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml、62.5 μg/ml、30 μg/ml的石墨烯干預接合轉移后，接合轉移頻率與空白對照組相比明顯升高，最高為濃度500 μg/ml，達到空白對照組60倍左右。隨著石墨烯濃度逐漸升高，接合轉移頻率呈現逐漸升高的趨勢，在濃度為500 μg/ml的時候達到高峰。當石墨烯濃度達1000 μg/ml時仍能促進接合轉移，但是其促進作用要低于500 μg/ml，但依然高于空白對照組。這些結果均表明石墨烯可以促進大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌的接合轉移，且結合轉移頻率與濃度相關。

圖1 石墨烯濃度對大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移的影響

在石墨烯對大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移的影響中，石墨烯可以促進接合轉移過程。與對照組相比，石墨烯濃度為1000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml、62.5 μg/ml、30 μg/ml時能明顯促進接合轉移過程，且差異有顯著性意義(*P<0.05、**P<0.01)，濃度為10 μg/ml也能明顯促進接合轉移過程，但差異無顯著性差異(P>0.05)

2.2 初始菌濃度對大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移的影響在石墨烯濃度為500 μg/ml時，初始菌濃度對石墨烯對大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移的影響(如圖2所示)。接合菌液濃度為106-109CFU/ml時，隨著接合菌液濃度的升高，接合轉移頻率明顯呈現上升的趨勢，109CFU/ml時達到相應空白對照組的70倍左右。當接合菌濃度約為106CFU/ml時，空白對照組和實驗組無顯著差異。結果均表明石墨烯可以促進大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因的接合轉移，且結合轉移頻率與初始菌液濃度相關。

圖2 初始菌濃度對大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移的影響

2.3 接合子驗證每項實驗隨機挑取的3個單個接合子菌落在含有40 μg/ml四環素和2 μg/ml美羅培南的LB培養基均生長良好。將接合子清洗2遍后將菌液按梯度稀釋后傾注在雙抗LB培養基選擇平板上，放于37 ℃電熱恒溫培養箱中培養，均有良好生長。

在初始菌濃度對石墨烯對大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移的影響中。接合菌液濃度為106-109cfu/ml時，隨著接合菌液濃度的升高，接合轉移頻率明顯呈現上升的趨勢，且107-109cfu/ml時與對照組相比，有顯著性差異(*P<0.05、**P<0.01)。當接合菌濃度約為106cfu/ml時，空白對照組和實驗組無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

石墨烯可以顯著地促進大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因的接合轉移，在石墨烯濃度為10 μg/ml-500 μg/ml時，隨著石墨烯濃度的升高，結合轉移的促進作用逐漸增強；在濃度為500 μg/ml-1000 μg/ml時，促進作用又開始逐漸減弱，但也明顯超過對照組。在接合條件為37 ℃、菌液濃度為108CFU/ml、結合時間為8 h的作用體系下，石墨烯濃度為250 μg/ml時，接合轉移頻率較對照組上升約40倍左右，500 μg/ml 石墨烯干預下產生的接合轉移頻率最高，是空白對照組的60倍左右，隨后開始下降。在石墨烯濃度為500 μg/ml、初始菌濃度為106-109cfu/ml時，均對大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌耐藥基因接合轉移有明顯的促進作用。且隨著接合菌液濃度的升高，接合轉移頻率明顯呈現上升的趨勢，109CFU/ml時達到相應空白對照組的70倍左右，當接合菌濃度約為106CFU/ml時，空白對照組和實驗組無顯著差異，此結果與一些研究成果相似〔17〕。

已有一些研究表明，納米材料可以促進細菌的接合轉移過程。主要是通過納米材料激發細菌的氧化抗氧化反應，影響細菌細胞膜的通透性，為供體菌和受體菌的細胞膜融合和DNA 跨膜轉運提供適當的條件。納米材料可以產生活性氧(ROS)進而破壞細胞膜、損害DNA，對細菌有殺傷作用，導致細菌死亡〔18-19〕。適當的納米材料濃度能顯著地促進細菌的接合轉移過程，高于一定濃度時促進效率則降低〔14〕。也有研究表明，trbBp基因和trfAp基因是調控RP4接合轉移的兩個主要的調控基因〔20〕，納米Al2O3可以促進這些基因的表達進而促進結合轉移過程〔14〕，石墨烯作為納米材料中的一種，它是否也可促進這些基因的表達從而促進接合轉移過程，這一結果還有待下一步實驗驗證。石墨烯除了具備納米特性，還在工業領域中應用來提高其他材料的韌性〔21〕，不知這其中除了納米材料促進結合轉移之外，是否還存在石墨烯充當分散劑提供供、受體菌之間的連接從而促進接合轉移過程，這些問題都有待深一步的探討。