膜聯蛋白A7及血管內皮生長因子在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

佟力軍，王洪海

(1.內蒙古民族大學第二臨床學院(內蒙古林業總醫院) 病理科，內蒙古 呼倫貝爾 022150；2.大連醫科大學 基礎醫學院 病理學與法醫學教研室，遼寧 大連 116044)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其發病率位于女性惡性腫瘤的首位[1]。近年來其發病率呈現逐年升高趨勢，發病年齡趨于年輕化。目前，隨著我國居民健康意識的轉變及乳腺癌診斷、治療技術的提高，乳腺癌死亡率逐年下降。但值得注意的是，有部分乳腺癌患者治療后預后仍較差。研究表明，乳腺癌是一種異質性的惡性腫瘤，不同患者臨床預后存在一定差別[2]。隨著精準醫學時代的到來，分析乳腺癌組織中不同分子表達情況及對患者預后的影響對于指導治療具有重要的意義。膜聯蛋白A7(annexin A7,ANXA7)是膜聯蛋白超家族的重要成員之一，有研究報道，ANXA7與胃癌、直腸癌、肝癌等發生有密切關系[3-5]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一類分布廣泛的細胞生長因子，具有促進血管和淋巴管生成的作用，與腫瘤發生、發展和侵襲轉移密切相關[6]。但目前對于乳腺癌組織中ANXA7、VEGF的表達情況及兩者關系尚無定論。本研究探討ANXA7及VEGF在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義，旨在為乳腺癌的臨床診治提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月至2017年3月內蒙古林業總醫院收治的乳腺癌患者94例，納入標準：(1)所有患者均為初發、單側乳腺癌患者，并經病理診斷為浸潤性導管癌；(2)接受手術治療，術后完成3年隨訪；(3)病歷資料完整，患者及家屬對研究知情同意。排除標準：(1)失訪患者；(2)三陰性乳腺癌患者；(3)合并其他系統腫瘤患者?；颊吣挲g35～78歲，平均年齡(50.26±5.63)歲；腫瘤直徑：≤2 cm 37例、>2 cm 57例；病理分級：Ⅰ級32例、Ⅱ級39例、Ⅲ級23例；TNM分期：Ⅰ期33例、Ⅱ期30例、Ⅲ期31例；有淋巴道轉移28例，無淋巴道轉移66例。標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，并經兩位高年資病理醫師復診。本研究經過醫院倫理學審查同意。

1.2 方 法

所有患者手術中切取乳腺癌組織及距離腫瘤邊緣3 cm的癌旁組織，經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4 μm連續切片。應用Roche Ventana Benchmark XT全自動免疫組化儀進行檢測，試劑為兔抗人ANXA7單克隆抗體、兔抗人VEGF多克隆抗體、兔抗人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)單克隆抗體、兔抗人雌激素受體(estrogenreceptor,ER)單克隆抗體、兔抗人孕激素受體(progesteronereceptor,PR)單克隆抗體、免疫組化染色試劑盒、DAB顯色液，均為Roche公司生產的配套試劑。程序如下：76 ℃脫蠟4 min，緩沖液沖洗，37 ℃過氧化氫甲醇消化內源性過氧化物酶4 min，緩沖液沖洗，pH值8.0～8.5的抗原修復緩沖液100 ℃抗原修復15 min，緩沖液沖洗，加入山羊血清封閉，加入生物學一抗37 ℃下12 min，生物學二抗37 ℃下8 min，緩沖液沖洗，DAB顯色，蘇木素復染、返藍、取出完成的玻片，常規酒精脫水、透明、中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察，用PBS代替生物學一抗作陰性對照，用說明書配套陽性樣本作為陽性對照。

1.3 結果判定

根據顯色程度及陽性細胞所占比例進行評分[7]：標本無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。再將兩項積分乘積得總積分：總積分 0～3分為(-)；總積分4～5分為(+)；總積分6～7分為(++)，總積分8分以上為(+++)。(+)～(+++)判定為陽性。

1.4 隨 訪

所有患者隨訪3年，隨訪時間至2020年3月結束。觀察患者復發及遠處轉移發生率，根據情況分為復發組、未復發組；遠處轉移組、無遠處轉移組。

1.5 臨床病理參數分析

分析不同年齡、腫瘤大小、病理分級、TNM分期、淋巴結轉移、HER-2、ER、PR表達情況、復發、遠處轉移情況患者乳腺癌組織中ANXA7、VEGF陽性表達情況。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織中ANXA7、VEGF蛋白表達情況

乳腺癌組織ANXA7、VEGF陽性率顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見表1，圖1。

表1 乳腺癌組織及癌旁組織中ANXA7及VEGF的表達 [n(%)]

A:乳腺癌組織中ANXA7表達(+++)；B:乳腺癌旁組織中ANXA7表達(-)；C:乳腺癌組織中VEGF表達(+++)；D:乳腺癌旁組織中VEGF表達(-)圖1 免疫組織化學法檢測ANXA7、VEGF在乳腺癌組織中的表達(×400)Fig.1 Expression of ANXA7,VEGF in breast cancer tissues was detected by immunohistochemistry (×400)

2.2 ANXA7、VEGF蛋白在乳腺癌組織中表達與臨床病理參數的關系

乳腺癌組織中不同年齡、腫瘤大小、ER、PR表達情況ANXA7、VEGF陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)。隨病理分級升高乳腺癌組織中ANXA7陽性率升高，VEGF陽性率升高，TNM Ⅲ期、HER-2陽性、淋巴結轉移乳腺癌組織ANXA7、VEGF陽性率顯著高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、HER-2陰性、無淋巴結轉移乳腺癌組織(P<0.05)。見表2。

所有患者完成3年隨訪，復發15例，復發率15.96%，遠處轉移9例，遠處轉移率9.57%。復發組ANXA7陽性率顯著高于未復發組，遠處轉移組ANXA7陽性率顯著高于未轉移組(P<0.05)；復發組VEGF陽性率與未復發組比較，差異無統計學意義，遠處轉移組VEGF陽性率與無遠處轉移組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 ANXA7、VEGF蛋白在乳腺癌組織中表達與臨床病理參數的關系[n(%)]

2.3 乳腺癌組織中ANXA7蛋白與VEGF蛋白表達的相關性

ANXA7蛋白陽性乳腺癌組織中VEGF蛋白陽性率顯著高于ANXA7蛋白陰性乳腺癌組織(P<0.05)，見表3。Spearman相關分析顯示，乳腺癌組織中ANXA7蛋白表達與VEGF蛋白表達呈正相關(rs=0.211，P=0.041)。

3 討 論

ANXA7又稱為會連蛋白，最初是從牛腎上腺髓質中分離出來，是細胞內含量最為豐富的蛋白質之一[8]。人類ANXA7基因位于染色體10q21，其編碼蛋白質具有Ca2+依賴的膜融合活性，可以促進膜融合、黏附、聚集、運輸等[9-10]。研究表明，ANXA7還可以激活GTP酶，通過介導Ca2+/GTP信號通路，影響細胞的增殖與分化[11]。已有研究報道，在多種惡性腫瘤組織中存在ANXA7表達增高[12-13]。田煥娜等[14]報道，下調ANXA7可以促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡，抑制腫瘤增殖，并認為ANXA7 可以促進乳腺癌發生。Wang XY等[15]報道ANXA7可以調節腫瘤淋巴管生成，促進淋巴道轉移。眾所周知，惡性腫瘤的生長與血管生成有密切關系，腫瘤細胞的增殖迅速，需要豐富的血管為其分裂、增殖、浸潤和轉移提供物質基礎。VEGF是目前已知的最重要的促進血管形成的細胞因子，具有促進血管內皮細胞增殖、遷移和血管形成的作用[16]。

表3 不同VEGF表達情況乳腺癌組織中ANXA7表達情況 [n(%)]

我們通過對94例乳腺癌及其癌旁組織中ANXA7蛋白及VEGF蛋白表達情況的檢測分析發現，乳腺癌組織中ANXA7、VEGF蛋白陽性率顯著高于癌旁組織，該結果與田煥娜的研究結果相符，表明ANXA7高表達與乳腺癌的發生有密切關系，分析ANXA7高表達可能通過抑制乳腺細胞凋亡、促進乳腺細胞惡性增殖，進而導致乳腺癌的發生。而VEGF蛋白高表達則與乳腺細胞惡性增殖、腫瘤周圍血管及淋巴管生成增加有關[17]。進一步分析發現，隨TNM分期升高，乳腺癌組織中ANXA7、VEGF蛋白陽性率升高，病理分級Ⅲ級、HER-2陽性、淋巴結轉移的乳腺癌組織ANXA7、VEGF蛋白陽性率顯著高于病理分級Ⅰ～Ⅱ級、HER-2陰性、無淋巴結轉移的乳腺癌組織，推測ANXA7、VEGF可能與乳腺癌患者病理分級、TNM分期、淋巴結轉移有密切關系。HER-2是一類原癌基因，其表達蛋白是一種跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶活性[18]。研究表明，HER-2參與腫瘤的增殖、分化和凋亡，其表達情況與乳腺癌的預后密切相關，已成為指導乳腺癌治療及判斷預后的重要指標[19]。本研究結果顯示HER-2陽性乳腺癌組織ANXA7、VEGF蛋白陽性率顯著高于HER-2陰性乳腺癌組織，同時乳腺癌組織中ANXA7蛋白表達與VEGF蛋白表達呈正相關。推測HER-2可能與ANXA7、VEGF具有某種信號關聯，發揮協同作用，共同促進乳腺癌的發生和發展，其具體機制有待于進一步研究證實。淋巴轉移是乳腺癌轉移的重要方式。既往有報道顯示VEGF可以調節腫瘤淋巴管生成，促進乳腺癌淋巴道轉移[20]。而Wang J等[21]報道，ANXA7可以促進諸如肝細胞癌等上皮細胞腫瘤淋巴道轉移。我們結果也表明ANXA7、VEGF與乳腺癌淋巴結轉移有密切關系，為腫瘤淋巴結轉移的機制研究提供了依據。

本研究對患者進行了3年隨訪，并對患者預后進行了比較，結果顯示，復發組ANXA7陽性率顯著高于未復發組，遠處轉移組ANXA7陽性率顯著高于未轉移組。分析其原因可能與ANXA7可以促進腫瘤淋巴管生成，從而促進淋巴轉移有關。而復發組VEGF陽性率與未復發組比較差異無統計學意義，遠處轉移組VEGF陽性率與無遠處轉移組比較差異無統計學意義，則表明VEGF與乳腺患者近期預后無關，也可能與本研究中VEGF陰性組病例數較少有關。提示ANXA7可以對乳腺癌患者的預后判斷提供依據，也可對乳腺癌藥物治療提供研究方向。同時本研究也存在一定不足，我們的研究僅側重于ANXA7、VEGF與患者臨床病理特征及預后的分析，未涉及分子機制的研究，仍有待于今后進一步研究分析乳腺癌的分子生物學特征。

綜上所述，乳腺癌組織中存在ANXA7、VEGF蛋白表達增高，兩者在乳腺癌中表達呈正相關，ANXA7蛋白對乳腺癌的病理分級、TNM分期、腫瘤轉移及患者的復發及預后判斷具有一定價值，VEGF對乳腺癌的病理分級、TNM分期、腫瘤轉移的輔助判斷具有一定價值。