西葫蘆9－順式－環氧類胡蘿卜素雙加氧酶CpNCED2基因的克隆及其干旱響應模式研究

劉建汀 曾美娟 溫文旭 王 彬 陳敏氡 葉新如 朱海生 溫慶放

(福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室/福建省農業科學院作物研究所/福建省蔬菜工程技術研究中心，福建福州 350013)

西葫蘆(Cucurbita pepoL.) 為葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬(Cucurbita)一年蔓生草本植物，染色體組型為2n ＝2x ＝40。西葫蘆生長周期短，耐儲運，含有較多的維生素C、葡萄糖等營養物質，具有除煩止渴、潤肺止咳等功效，是我國冬春季節設施栽培主要蔬菜種類之一。生產過程中，連續高溫天氣容易形成干旱環境脅迫，影響西葫蘆生長發育、水分代謝、抗氧化系統平衡以及光合作用等，導致其產量嚴重下降[1－2]。持續的干旱脅迫會導致葉片中的脫落酸(abscisic acid，ABA)迅速增多，引起氣孔關閉，造成葉片凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度及胞間CO2濃度等光合指標下降，光合作用能力降低[3]。目前西葫蘆干旱脅迫相關的研究主要集中在生理生化水平[4－5]，但仍不清楚西葫蘆對干旱響應的生理機制及其調控機理。

9－順式－環氧類胡蘿卜素加雙氧酶蛋白(9-cisepoxycarotenoid dioxygenase，NCED)是內源ABA 合成的限速酶，在植物體中以基因家族的形式存在，其表達量的變化常與ABA 的含量密切相關[6－8]。研究表明，響應干旱等逆境脅迫能夠誘導NCED的表達從而調控內源ABA 合成[9－11]?；ㄉ?Arachis hypogaea)在干旱脅迫條件下，隨著內源ABA 含量的明顯增加，AhNCED1 基因表達量顯著上調，將AhNCED1 基因轉化至擬南芥突變體(129B08/nced3) 后，擬南芥中AhNCED1 基因超量表達，可恢復其在干旱脅迫下ABA的積累進而增強擬南芥抗干旱能力[12]。小麥(Triticum aesivum)中TaNCED基因受ABA、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和干旱脅迫顯著上調表達，將TaNCED基因在擬南芥中過表達可以提高其對干旱脅迫的耐受性[13]。在NCED基因響應玉米[14]、擬南芥[15]、柑橘[16]和百脈根[17]等植物干旱脅迫的研究中發現，干旱脅迫可以誘導NCED基因表達和內源ABA的積累，且在一定范圍內，該基因表達與ABA 積累會隨干旱時間延長而明顯增強，表明NCED基因在提高植物抗旱能力方面具有重要作用。

目前，國內外關于西葫蘆NCED基因克隆和功能分析的報道較少[18－19]。本研究前期在田間育種過程中發現1 個對干旱脅迫較為敏感的西葫蘆組合——福美6 號，并從構建的轉錄數據庫中篩選出1 條潛在與ABA 合成相關的NCED基因全長序列[20]。在此基礎上，本研究擬測定西葫蘆干旱脅迫后葉片光合參數、水勢以及ABA 含量的變化，分析西葫蘆NCED的基因序列特征和表達模式，以期了解西葫蘆NCED基因在干旱脅迫中的作用，為進一步揭示西葫蘆干旱脅迫的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

西葫蘆福美6 號品種由母本M016 和父本F031雜交選育而成。試驗選取50 粒飽滿的西葫蘆種子，清洗干凈后用次氯酸鈣溶液(100～200 mL·L－1)消毒10 min，用清水洗凈殘留的次氯酸鈣，于福建省農業科學院福清東張基地蔬菜育苗大棚內，播種于50 孔穴盤中，托盤(28×54 規格)中每天澆水量為1 L。待西葫蘆幼苗生長至兩葉一心時期，選取生長良好、大小均一的幼苗停止供水進行干旱處理(0、1、2、3 和4 d)，于每日上午9:00 測定葉片的水勢、光合參數，每個處理3次重復。采集葉片立即用液氮速凍，－80℃保存，共采集5 組材料，15 個樣品，用于后續ABA 含量測定和熒光定量PCR 試驗材料。

1.2 試驗試劑

TaqDNA Polymerase、dNTPs、pMD18-T simple 購自北京全式金生物技術有限公司，HiScript?ⅡSelect RT SuperMix for qPCR (＋gDNA wiper)反轉錄試劑盒購自大連寶生物公司，基因擴增試劑盒Phanta Max Master Mix、熒光定量試劑盒ChangesQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix、DL2000 plus DNA marker 購自南京諾唯贊生物科技有限公司，通用植物總RNA 提取試劑盒購于北京百泰克公司，膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購于美國Omega 公司，其他生化試劑和常規試劑均為超純或分析純級。

1.3 基因生物信息學分析

使用 DNAMAN Version 9 軟件和 ProtParam(https:/ /web.expasy.org/protparam/)對蛋白一級結構進行預測；利用Prabi 在線軟件(https:/ /npsa-prabi.ibcp.fr/)對蛋白進行二級結構分析；利用Wolf Psort 在線軟件(https:/ /www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)進行蛋白亞細胞定位預測；使用SWISS-MODEL(https:/ /swissmodel.expasy.org/interactive)進行蛋白模板比對，spdbv 軟件構建該蛋白三級結構模型，VMD 軟件進行蛋白模型呈現；利用MEGA 7 軟件最大似然法構建進化樹，1 000 次重復。

1.4 西葫蘆CpNCED2 基因克隆

參考試劑盒說明提取西葫蘆樣品的總RNA 及合成cDNA 第一鏈。參考前期轉錄組測序庫中搜索到的NCED基因全長序列，設計開放閱讀框架(open reading frame，ORF)全長克隆引物，正向擴增引物CpNCED2-F:GCTTCTTCCCCTTCTCCTCCTTGTCTCG 和反向擴增引物CpNCED2-R:TCTGGAAAAGGCACCACAACAAAA TAAG，PCR 擴增產物經1.0%瓊脂糖電泳、純化、回收后，pMD18-T 載體進行連接、轉化，PCR 檢測后的陽性克隆進行測序驗證。

1.5 基因定量引物設計及分析

采用在線引物設計軟件(https:/ /sg.idtdna.com)設計基因CpNCED2-Fq:5′-ACCATCAATGACGGCTCT -3′，CpNCED2-Rq:5′-ACTCCGGTTCCCTTCTTAT-3′，并使用本研究前期克隆獲得的CpActin作為西葫蘆熒光定量PCR 內參基因[20－21]。參照試劑盒說明書，配制25 μL 的反應體系，在QuantStudio 7 Flex 實時熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司)上進行擴增，反應體系:2 μL cDNA 模板，10 μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，0.4 μL 正向引物CpNCED2-Fq (10 μmol·L－1)，0.4 μL 反向引物CpNCED2-Rq (10 μmol·L－1)，加ddH2O 至25 μL。PCR 反應條件:95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，40 個循環。以上反應均重復3 次。在Excel 軟件中采用2－ΔΔCt法分析處理數據并得出目的基因的表達情況。

1.6 西葫蘆光合參數及葉片水勢的測量

利用GFS 3000 光合測量儀(WALZ，德國)測量西葫蘆葉片光系統Ⅱ最大量子效率(maximal quantum efficiency of photosystem Ⅱ，Fv/Fm)、凈光合速率(net photosynthesis，Pn)、非光化學淬滅系數( nonphotochemical quenching，NPQ)和光化學電子傳遞效率(electron transfer efficiency，ETR)4 個光合指標。測量程序:首先將西葫蘆葉片暗適應30 min，然后使用飽和脈沖光(12 000 μmol·m－2·s－1)測量暗適應后葉片的最大熒光(Fm)；在葉片恢復正常光照10 min(800 μmol·m－2·s－1，光飽和點)后分別測定光合參數Fv/Fm、Pn、NPQ 和ETR，3 次重復。葉片水勢的測量采用小葉流法，測定時間為早上9:00 左右，每個處理測定10 片。

1.7 西葫蘆葉片ABA 含量的測定

參考Xiao 等[22]的方法。試驗基于AB Sciex QTRAP 6500 LC-MS/MS 平臺進行:利用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)和串聯質譜(mass spectrometry，MS/MS)對所有樣本ABA 進行定性定量分析并采集數據；分別配制0.5、1、5、10、50 和100 ng·mL－1不同濃度的ABA 標準品溶液，獲取各個濃度標準品的對應定量信號的質譜峰強度數據，繪制ABA 的標準曲線；將檢測到的所有樣本ABA的積分峰面積比值代入標準曲線線性方程進行計算，得到實際樣本中ABA 的絕對含量。按照公式計算ABA 含量:

ABA 含量(ng·g－1)＝B*C/100/D

式中，B 為樣本中激素積分峰面積比值代入標準曲線得到的濃度值，ng·mL－1；C 為復溶時所用溶液的體積，μL；D 為稱取的樣本質量，g。

利用SPSS 19.0 數據處理軟件中單因素方差分析法對上述基因表達、葉片水勢、光合參數以及ABA 含量進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 西葫蘆CpNCED2 基因的獲得

前期對西葫蘆葉片進行了轉錄組測序，獲得25.5 Gb 有效數據，經組裝和拼接得到高質量的Unigenes 序列83 650 條(序列平均長度為722.16 nt)，其中Nr 注釋獲得12 893 條Unigene，并從中篩選(條件為E 值<10－5)得到一條全長為1 941 bp 的cDNA 序列，包含1個完整的ORF 和47 bp、127 bp 的上游和下游非編碼區[23－24](圖1)。同源性分析發現，該基因序列與NCBI已公布的中國南瓜(Cucurbita moschata，XM _023070380.1，E 值為0) 的核酸序列相似性高達98.15%，通過RT-PCR 擴增基因ORF 全長，經測序驗證后，將該基因命名為CpNCED2(圖2)。

圖1 西葫蘆CpNCED2 基因全長序列及其編碼的蛋白分析Fig.1 Full-length sequence of the CpNCED2 gene of Cucurbita pepo and its encoded protein analysis

圖2 CpNCED2 基因PCR 擴增產物Fig.2 PCR amplified product of CpNCED2 gene

2.2 基因序列的生物信息學分析

2.2.1CpNCED2 基因及其編碼蛋白的一級結構分析序列分析表明，CpNCED2 基因cDNA 全長1 941 bp，ORF 為1 767 bp，分子式C2946H4556N814O861S18。利用EditSeq 5.01 和ProtParam 軟件對西葫蘆CpNCED2和中國南瓜、印度南瓜、絲瓜、甜瓜、黃瓜、葡萄和可可編碼同源蛋白的組成成分及理化性質進行分析(表1)。結果表明，這些植物中NCED 蛋白的氨基酸殘基數為588～613 個，理論相對分子質量為65.73～68.71 kDa，等電點(pI)為6.66～8.23。CpNCED2 基因編碼蛋白的堿性氨基酸數略多于酸性氨基酸數，脂肪族氨基酸數明顯多于芳香族氨基酸數。不同植物NCED 中氨基酸理化性質較為一致，存在的差異可能與蛋白非保守區域的氨基酸差異有關。分析發現，蛋白質總平均疏水性(grand average of hydropacthicity，GRAVY)為－0.3 左右，均屬親水性蛋白質。

表1 不同植物來源NCED 的氨基酸組成成分及理化性質分析Table 1 The comparison of composition and physical and chemical characterization of amino acid of NCED from different plant species

2.2.2 CpNCED2 蛋白的二級、三級結構分析 西葫蘆CpNCED2 蛋白二級結構分析顯示，該序列中α－螺旋結構占比20.27%、β－折疊占比7.31%、β－轉角占比72.62%(圖3-A)。該蛋白三級結構如圖3-B 所示，模型RF(ramachandran favoured)值為91.05%。

圖3 CpNCED2 蛋白二級(A)和三級(B)結構預測Fig.3 Prediction of secondary(A) and tertiary(B)structure of CpNCED2

2.2.3 CpNCED2 蛋白的同源比對與進化分析 將西葫蘆編碼氨基酸序列與GenBank 數據庫中其他植物NCED 序列進行比對，結果表明西葫蘆CpNCED2(XP_023543156.1)與其他物種NCED 序列具有較高的同源性，其中與中國南瓜(XP_022926148.1)、印度南瓜(XP_022978939.1)、絲瓜(APO14274.1)、香瓜(XP_008439625.1)和黃瓜(XP_004134911.1)蛋白序列相似度較高，分別為99%、99%、85%、85%和84%，具有高度的保守性。Pfam 分析發現，CpNCED2 氨基酸序列含有4 個保守組氨酸位點(His284、His333、His398和His575)和2 個NCED 蛋白保守結構域(281～289和333～340 位)(圖4)。

圖4 CpNCED2 與其他物種中的同源蛋白的多重比對Fig.4 Multiple sequence alignment of CpNCED2 with other homologous sequences

對西葫蘆和15 個物種的NCED 序列進行系統進化分析，西葫蘆NCED 與甜瓜、黃瓜和絲瓜等葫蘆科作物的NCED 蛋白同聚一類，親源關系較近，與巴西橡膠樹、木薯和麻風樹等大戟科的NCED 蛋白親緣關系較遠，聚類結果與植物系統分類一致(圖5)。

圖5 NCED 蛋白分子進化分析Fig.5 Molecular phylogenetic analysis of NCED protein

2.3 干旱條件對西葫蘆葉片光合特性的影響

采用小葉流法測定了西葫蘆葉片中的水勢變化，由圖6可知，隨著干旱脅迫的產生，西葫蘆葉片的水勢在停止澆水后0、1、2、3、4 d 逐漸降低，并達到顯著差異水平(P<0.05)。

圖6 干旱脅迫下西葫蘆葉片水勢變化Fig.6 The water potential changes in Cucurbita pepo leaves under drought stress

光合參數測定結果表明，干旱脅迫后1、2、3、4 d西葫蘆葉片的Pn、Fv/Fm、NPQ 以及RTR 呈明顯下調趨勢，并達到顯著差異水平(P<0.05)，表明干旱脅迫后葉片的光合作用能力明顯下調(圖7)。

圖7 干旱脅迫對西葫蘆葉片光合特性的影響Fig.7 Determination of photosynthetic parameters of Cucurbita pepo under drought stress

2.4 干旱脅迫下西葫蘆葉片中的ABA 含量變化

通過配置6 種不同濃度梯度ABA 標準品溶液，獲取各個濃度梯度標準品對應信號的質譜峰強度數據，以標準品濃度(ng·mL－1)為橫坐標，外標/內標峰面積比為縱坐標，得到標準曲線線性方程y＝0.039 19x－0.001 80(相關系數R＝0.997 43，權重＝1/x)(圖8)。

圖8 ABA 測量的標準曲線Fig.8 The standard curve of ABA measurement

設定2.00E－01 和1 000 ng·g－1作為定量上限和下限，將西葫蘆干旱處理(0、1、2、3、4 d)葉片ABA 的峰值代入標準曲線線性方程計算得到ABA 的絕對含量。結果表明，隨著干旱脅迫天數的增加，西葫蘆葉片中的ABA 含量逐漸升高，并達到了顯著差異水平(P<0.05)(圖9)。

圖9 干旱脅迫條件下西葫蘆葉片ABA 含量的變化Fig.9 The ABA content of Cucurbita pepo leaves under drought stress

2.5 CpNCED2 基因在西葫蘆干旱脅迫中的表達分析

熒光定量PCR 分析結果表明，伴隨西葫蘆干旱脅迫的產生，CpNCED2 基因在停止澆水后0、1、2、3 和4 d 呈現先上調后下調的表達趨勢，1、2、3 和4 d 的表達量均高于0 d，基因表達量在3 d 時達到最高，上調倍數達到8 倍左右，達到顯著差異水平(P<0.05)(圖10)。

圖10 干旱脅迫下西葫蘆CpNCED2 的表達分析Fig.10 Expression analysis of CpNCED2 in Cucurbita pepo under drought stress

3 討論

NCED基因在1997年首先從玉米ABA 缺失突變體viviparousl4(vpl4)中分離鑒定出來[14]，隨后從菜豆[25]、鱷梨[26]、擬南芥[27]、草莓[28]和蘋果[10]等物種中被陸續克隆出來。目前，GenBank 上已經登錄了西葫蘆NCED基因家族片段，但國內外對于西葫蘆NCED基因克隆和功能分析的研究報道較少。本研究從前期西葫蘆轉錄組數據庫中篩選得到1 條全長為1 941 bp 的cDNA 序列，與南瓜中NCED 的核酸序列相似性達到98.15%，包含1 個1 767 bp 的ORF，基因編碼蛋白在Nr 中的功能注釋為NCED(E 值為0)。同源性分析表明，西葫蘆CpNCED2 與同為葫蘆科的中國南瓜、印度南瓜和絲瓜等的NCED 蛋白序列具有很高的同源性，相似性均在85%以上，表明NCED 蛋白在進化過程中的保守性。蛋白系統進化分析表明，西葫蘆CpNCED2 與甜瓜和黃瓜等葫蘆科作物的NCED 蛋白親源關系較近，聚為一類，與巴西橡膠樹、木薯和麻風樹等大戟科的NCED 蛋白親緣關系較遠。對CpNCED2 蛋白進行BLASTp 和Pfam 分析發現，CpNCED2 具有2 個高度保守的結構域，含有4 個保守組氨酸位點和2 個NCED 蛋白保守結構域，屬于典型的RPE65 超級家族，亞細胞定位預測該蛋白在葉綠體中[29]，表明CpNCED2 蛋白主要在葉綠體中起作用[30]。

葉片是植物光合作用的重要場所，水分的缺乏對其光合作用具有重要影響。研究表明，長期干旱脅迫顯著降低辣椒、黃瓜等作物葉片中葉綠素含量，使其氣孔導度(stomatal conductance，Gs)、光化學猝滅系數(qP)、天線色素捕光效率(Fv/Fm)以及光合作用關鍵酶RuBP 羧化酶活性明顯下降，減緩淀粉等糖類物質運輸，形成對光合作用反饋調節，從而顯著降低Pn，影響植株的生長發育[31－33]。Ors 等[34]通過減少正常澆水量的67%對西葫蘆幼苗進行干旱脅迫處理，發現25 d 后葉片蒸騰速率(Tr)、Gs、Pn 和植株鮮重分別下降62%、62%、69%和63%。Pn、Fv/Fm、NPQ 和ETR 等光合參數可作為衡量西葫蘆葉片干旱脅迫程度的重要指標[35]。本研究結果發現，隨著西葫蘆干旱脅迫產生，停水處理0、1、2、3、4 d 后葉片中水勢逐漸降低，其葉片中相應的光合指標Pn、Fv/Fm、NPQ 和ETR 也呈明顯下調趨勢，表明干旱脅迫對西葫蘆葉片光系統造成了嚴重破壞，并導致葉片光合作用能力下降。

前人研究表明，ABA 對于植物迅速、有效地響應逆境脅迫具有重要作用，是干旱脅迫應答基因調控網絡中的重要組成。NCED 是植物ABA 生物合成途徑的關鍵限速酶，該基因的表達模式直接影響ABA 代謝合成，從而影響植物抵抗干旱等環境脅迫能力。植物中NCED基因能夠響應干旱脅迫的產生，快速形成上調表達模式，與干旱程度顯著相關。馬鈴薯(Solanum tuberosum)中[36]，StNCED1 表達量在干旱脅迫后表現出先降低后升高趨勢。糜子(P.miliaceumvar.compactrm)中[29]，PmNCED1 的表達量隨著PEG 脅迫時間延長而升高。水稻(Oryza sativa)中[37]，OsNCED3基因的表達受干旱脅迫誘導，復水處理后其表達快速下調。本研究結果表明，伴隨西葫蘆葉片干旱脅迫的產生，其體內ABA 含量顯著升高，CpNCED2 基因在停止澆水后0～4 d 內呈現先上調后下調的表達趨勢，3 d時上調倍數達到8 倍左右，ABA 含量和CpNCED2 基因表達量的變化趨勢基本一致。CpNCED2 基因在4 d時出現下調表達趨勢，可能由于干旱脅迫后造成嚴重缺水，西葫蘆葉片過度萎蔫，其中細胞內酶活性降低，導致體內mRNA 含量降低而引起總體基因表達量下降。綜上所述，推測CpNCED2 基因能夠快速響應干旱脅迫的產生，并在西葫蘆葉片ABA 合成過程中起著重要調控作用，但相關研究結果還需要做進一步功能驗證。

4 結論

本研究從西葫蘆轉錄組數據庫篩選出一條CpNCED2 基因，其全長1 941 bp，編碼蛋白與中國南瓜和印度南瓜同源性均高達99%，具有高度的保守性。CpNCED2 編碼的蛋白含有4 個保守組氨酸位點和2 個NCED 蛋白保守結構域，屬于典型的NCED家族基因。分析發現，隨著干旱脅迫天數的增加，西葫蘆葉片中水勢逐漸降低，Pn、Fv/Fm、NPQ 和ETR 等葉片光合指標顯著下降，ABA 含量逐漸升高，CpNCED2 基因呈顯著上調表達。因此，推測CpNCED2 基因在西葫蘆干旱脅迫應答以及ABA 代謝合成過程中具有重要的調控作用。