鹽堿脅迫下野生大豆CBL-CIPK通路表達分析

魏志園 王 宇 司增志 魏 萊 溫曉蕾 喬亞科 李桂蘭 張 鍇

(1河北科技師范學院農學與生物科技學院，河北秦皇島 066000；2河北科技師范學院園藝科技學院，河北秦皇島 066000)

我國是大豆的起源地，保存有豐富的野生大豆(Glycine soja)資源。野生大豆常生長在沿海灘涂、鹽堿荒地等環境中，是典型的鹽生植物。在野生大豆優質基因利用方面，我國學者通過野生大豆與栽培大豆(Glycine max)雜交育種技術已培育出一些優異的種質資源[1－6]。雖然我國擁有豐富的野生大豆種質資源，但我國對野生大豆的育種利用還不充分。在中美貿易談判及國內非轉基因大豆需求量增加的背景下，進一步充分利用野生大豆種質資源，應用傳統技術培育栽培大豆新品種成為解決我國大豆供需矛盾的重要途徑。

近年來野生大豆的優異特性尤其是耐鹽堿性已成為學者的研究重點。野生大豆對鹽堿脅迫的反應比較復雜[7]。肖鑫輝等[8]研究發現，高耐鹽堿型野生大豆材料在鹽堿脅迫下莖、葉平均Na＋和Cl－含量顯著低于低耐鹽型，但高耐型野生大豆植株莖葉中也存在Na＋和Cl－含量高水平和低水平兩種類型，推測野生大豆可能存在高耐受性和低吸收性兩種耐鹽堿機制。此外，研究發現野生大豆可以通過增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)及過氧化物酶(peroxidase，POD)等抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化物丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量來提高自身耐鹽性[9－10]。野生大豆具有較強的抗逆能力，近年來學者對其耐鹽堿性進行了諸多探索[11－15]。但是，目前野生大豆耐鹽堿生理機制，尤其是野生大豆鹽堿脅迫下植株體內的離子平衡機制還不清楚，耐鹽堿關鍵基因表達及調控機制尚不明確。

類鈣調磷酸酶B 蛋白(calcineurin B-like protein，CBLs)是植物中重要的Ca2＋離子感受器。擬南芥CBLs蛋白含有4 個EF 手結構，是Ca2＋離子的結合位點，它們的排列順序和間距高度保守[16－17]。CBLs 蛋白N－端具有豆蔻?；?myristoylation)和棕櫚?；?palmitoylation)兩個脂質修飾位點，介導CBLs 蛋白在胞內的定位。CBLs 互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase，CIPKs)是一類植物特有的絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶，其蛋白的C 端含有天冬酰胺－丙氨酸－苯丙酰胺(NAF)結構域，介導CIPKs 蛋白與CBLs 蛋白的互作；N 端含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域，具有激酶催化活性[17]。目前研究發現，擬南芥(Arabidopsis)中存在10 個CBLs蛋白和26 個CIPKs 蛋白，栽培大豆(G.max)中存在7個CBLs 蛋白和13 個CIPKs 蛋白[18－20]。擬南芥中CBLs蛋白定位在質膜、液泡膜、細胞質及細胞核中[21－24]，而由于CIPKs 蛋白缺少定位信號結構域，在正常狀態下CIPKs 定位在細胞質和細胞核中，當CIPKs 與CBLs 蛋白互作形成CBL-CIPK 復合體會重新定位至質膜或液泡膜上[21，25]。

擬南芥AtCBL4 基因(也稱salt-overly-sensitive 3，SOS3)可以響應多種逆境，包括鹽堿、低鉀、干旱和低溫等脅迫。在脅迫條件下，植株胞內Ca2＋積累，Ca2＋可介導AtCBL4 蛋白與AtCIPK24 蛋白(也稱SOS2)形成AtCBL4-AtCIPK24 復合物[26]，AtCBL4 蛋白N 端豆蔻?；閷tCBL4-AtCIPK24 復合物移動到質膜上。AtCBL4-AtCIPK24 復合物可磷酸化質膜上的SOS1(salt-overly-sensitive 1)蛋白[27－28]。SOS1 是定位在質膜上的Na＋/H＋反向轉運蛋白，在鹽脅迫下，AtCIPK24可磷酸化SOS1 自抑制結構域中的絲氨酸殘基，激活SOS1 的轉運活性，導致Na＋轉運出細胞，這對高鹽脅迫下保持細胞Na＋平衡，維持細胞滲透壓十分重要[29]。另外，AtCBL10 也可與AtCIPK24 互作，形成的AtCBL10-AtCIPK24 復合物移動到液泡膜上，激活AtNHX(vacuolar Na＋/H＋exchanger)蛋白活性。NHX是存在于液泡膜上的Na＋/H＋轉運蛋白，激活后可使胞質中的Na＋轉運至液泡中，進一步降低細胞內的Na＋濃度。液泡中積累的Na＋也可以作為滲透壓降低細胞水勢，促進植物在鹽脅迫下吸水[30]。由此可見，CBLCIPK 信號通路對植物鹽脅迫的抗性十分重要[31－32]。

本研究前期對野生大豆材料進行耐鹽堿鑒定，篩選到高耐鹽堿野生大豆材料2010－12。為進一步揭示野生大豆耐鹽堿機制，選擇高耐鹽堿野生大豆2010－12 和敏感型野生大豆2012－49 為試驗材料，在鹽堿脅迫處理后0(鹽堿脅迫處理后立即取樣)、3、10 h 進行轉錄組分析。鑒于CBL-CIPK 信號通路在植物耐鹽堿脅迫中發揮重要作用，且野生大豆CBL-CIPK 信號通路對鹽堿脅迫的響應機制尚不清楚，本研究在轉錄組分析基礎上，進一步分析野生大豆中CBL-CIPK 信號通路的蛋白結構、亞細胞定位、磷酸化位點及鹽堿脅迫下高耐/敏感野生大豆材料基因表達特點，旨在揭示CBL-CIPK 信號通路基因在野生大豆耐鹽堿脅迫中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及方法

高耐鹽堿野生大豆材料2010－12 和敏感野生大豆材料2012－49，由河北科技師范學院野生大豆課題組提供。

用小刀劃破野生大豆種子泥漿膜后，播種于鋪滿營養土的培養缽中，上覆薄層蛭石。培養缽置于溫室(25℃光16 h/15℃暗8 h)。待野生大豆長出真葉后，移栽至裝有30 mL 霍格蘭培養液的50 mL 離心管中，置于相同光照培養條件的培養箱中，濕度60%，5 d 后進行鹽堿脅迫處理。處理液按NaCl ∶Na2CO3(無水)＝1 ∶3 質量分數配制[33]，調pH 值至8.0，濃度為100 mmol·L－1。處理0(澆灌處理液后立即取樣)、3、10 h后分別取兩種野生大豆材料的葉片1 g，迅速保存于液氮中，所有樣品設3 次生物學重復。

1.2 測序數據來源

提取野生大豆葉片RNA，構建cDNA 文庫，送至華大基因(北京)利用BGISEQ－500 平臺進行轉錄組測序。利用Trimmomatic(v0.36)軟件對原始數據進行過濾，HISAT2(v2.1.0)軟件比對野生大豆參考基因序列。通過華大基因交互系統(https:/ /report.bgi.com/ps/login/login.html)篩選CBL 和CIPK 通路基因，并利用栽培大豆中CBL 和CIPK 通路基因序列與本地轉錄組數據進行BLAST 比對。

1.3 預測數據來源

通過NCBI(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得CBLs和CIPKs基因的蛋白序列，利用MEME(http:/ /alternate.meme-suite.org/tools/meme)在線分析工具進行蛋白結構域預測。利用BUSCA (http:/ /busca.biocomp.unibo.it/)在線分析工具進行蛋白亞細胞定位預測。利用NetPhos 3.1 Server(http:/ /www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線分析工具進行蛋白磷酸化位點預測。

1.4 數據分析

CBLs和CIPKs基因表達量采用FPKM(fregments per kilobase per million)法進行計算，?。黮og2FoldChange ｜>1.5 為組間差異顯著。利用Heml(v 1.0.3.7)軟件對取對數值(log2)的基因表達量進行聚類分析。利用MEGA7 軟件對野生大豆和栽培大豆的CBL-CIPK基因進行系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 野生大豆CBL-CIPK 通路基因鑒定

對高耐鹽堿及敏感野生大豆材料鹽堿脅迫處理0、3、10 h 后的轉錄組測序，結果發現，18 組樣品(3 次生物學重復) 共鑒定819.52 M Clean Reads，包括122.91 Gb Clean Bases。通過與已公布的野生大豆(G.soja)基因組比對，鑒定到已知轉錄本48 875 個，新轉錄本32 331 個。新轉錄本中具有蛋白編碼潛力的轉錄本25 036 個，新基因1 780 個。

鑒定到CBL-CIPK 信號通路基因共48 個，其中CBLs基因10 個，CIPKs基因38 個。對篩選到的基因進行KO 注釋，發現9 個CBLs基因匹配到K06268(絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2B 調節亞基，serine/threonine-protein phosphatase 2B regulatory subunit)中。30 個CIPKs基因匹配到K07198(5′-AMP 激活蛋白激酶，催化α 亞單位，5′-AMP-activated protein kinase，catalytic alpha subunit)中，14 個匹配到K12761(碳代謝解壓蛋白激酶，carbon catabolite-derepressing protein kinase)中(附表1)。

附表1 轉錄組分析鑒定的野生大豆CBL-CIPK 信號通路基因表達量Enclose Table 1 Gene expression of wild soybean CBL-CIPK proteins indentified by trascriptome analysis

2.2 野生大豆CBL-CIPK 蛋白結構域預測

對野生大豆CBLs 蛋白結構域預測發現，10 個CBLs 蛋白均含有3 個EF 手結構(圖1-A)。雖然EF手結構在10 個CBLs 蛋白氨基酸序列的位置不同，但3 個EF 手結構之間的排列及它們之間的距離均一致。分析EF1、EF2 和EF3 蛋白基序發現，10 個EF 手結構氨基酸序列保守程度較高，說明該結構域對CBLs 蛋白發揮功能較重要。

對野生大豆38 個CIPKs 蛋白結構域預測發現，32個CIPKs 蛋白含有ATP 結合結構域(ATP binding domain)，36 個含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性結構域(serine/threonine protein kinase active domain，ST)，17 個含有天冬酰胺－丙氨酸－苯丙氨酸保守結構域(Asn-Ala-Phe 結構域，NAF 結構域)。從3 個結構域基序的分析結果可知(圖1－B)，ATP 結合結構域和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性結構域高度保守，說明這兩個結構域對CIPKs 蛋白較重要。NAF 結構域兩端不保守，只在Asn-Ala-Phe 氨基酸位點保守程度較高。除這3 個結構域外，一些CIPKs 蛋白還含有一些保守結構域，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性結構域兩端的結構域，它們共同介導了CIPKs 的蛋白激酶活性。

圖1 野生大豆CBL-CIPK 蛋白結構域及重要結構域基序預測結果Fig.1 Prediction results of CBL-CIPK proteins domain and domain motif of wild soybean

2.3 野生大豆CBL-CIPK 蛋白亞細胞定位預測

對10 個CBLs 蛋白亞細胞定位預測發現，7 個CBLs蛋白位于細胞核中，1 個CBLs 蛋白位于細胞質中，1 個位于葉綠體中，1 個位于內膜系統上。對38 個CIPKs 蛋白亞細胞定位預測發現，20 個CIPKs 蛋白定位在細胞質中，占52.6%，9 個定位在葉綠體中，占23.6%，6 個定位在細胞核中，占15.7%，另有3 個分別位于細胞器膜、線粒體和內膜系統上，分別均占2.6%(表1)。

表1 CBL-CIPK 蛋白亞細胞定位及磷酸化位點預測結果Table 1 Subcellular localization and phosphorylation site prediction of CBL-CIPK proteins

表1(續)

2.4 野生大豆CBL-CIPK 蛋白磷酸化位點預測

對CBL-CIPK 蛋白磷酸化位點預測發現，CBLs 蛋白磷酸化修飾以絲氨酸(Ser)位點最多，占總數的52.3%～73.1%，蘇氨酸(Thr)位點次之，占19.2%～45.8%，酪氨酸(Tyr)位點最少，占0～14.3%。CIPKs蛋白磷酸化修飾也以絲氨酸(Ser)位點最多，占40.6%～77.8%，蘇氨酸(Thr)位點次之，占13.3%～46.7%，酪氨酸(Tyr)位點最少，占0～22.7%(表1)。

10 個CBLs 蛋白平均每個蛋白發生12.0 次絲氨酸(Ser)位點磷酸化修飾，7.0 次蘇氨酸(Thr)位點磷酸化修飾，0.8 次酪氨酸(Tyr)位點磷酸化修飾；38 個CIPKs 蛋白平均每個蛋白發生20.6 次絲氨酸(Ser)位點磷酸化修飾，9.9 次蘇氨酸(Thr)位點磷酸化修飾，3.9 次酪氨酸(Tyr)位點磷酸化修飾(表1)。

圖2 鹽堿脅迫下野生大豆CBLs 蛋白(A)和CIPKs 蛋白(B)基因表達聚類分析Fig.2 The cluster analysis of gene expression of CBLs protein (A) and CIPKs protein (B) in wild soybean under saline-alkali stress

2.5 野生大豆鹽堿脅迫下CBL-CIPK 基因表達模式分析

對10 個CBLs基因表達模式進行分析發現，高耐鹽堿野生大豆材料GsCBL3(D0Y65_047783)基因在鹽堿脅迫處理后3、10 h 的表達量與0 h 相比下調。高耐鹽堿野生大豆材料GsCBL1 (D0Y65 _045867) 和GsCBL4(D0Y65_014543)基因在鹽堿脅迫處理后10 h的表達量與0、3 h 相比均上調。兩個耐性不同的野生大豆材料比較，在鹽堿脅迫處理0、10 h 后，GsCBL10(D0Y65_046727)基因在高耐鹽堿材料中的表達量比敏感材料上調，其余基因各時間點相比均無差別。

38 個CIPKs基因表達模式分析發現，兩個耐性不同的野生大豆材料對比，在鹽堿脅迫處理0 h 后，GsCIPK10_like(D0Y65_004857)基因在高耐鹽堿野生大豆材料中的表達量比敏感材料上調，其余基因各時間點相比均無差別。

2.6 野生大豆與栽培大豆CBL-CIPK 基因系統發育分析

通過NCBI 檢索到栽培大豆(G.max)CBLs基因6個，CIPKs基因15 個。利用MEGA7 軟件分別分析野生大豆與栽培大豆CBL家族基因和CIPK家族基因的進化關系。結果發現，野生大豆與栽培大豆CBLs基因親緣關系較近，野生大豆與栽培大豆的CBL1、CBL3、CBL4、CBL7、CBL10 分別聚為一類，證明其同源性很高。野生大豆與栽培大豆CIPKs基因也高度同源，野生大豆與栽培大豆的CIPK1、CIPK2、CIPK3、CIPK4、CIPK5、CIPK6、CIPK8、CIPK9、CIPK10、CIPK11、CIPK12、CIPK14和CIPK23 分別聚為一類，證明這些基因同源關系很高。但野生大豆GsCIPK5_like 基因與栽培大豆GmCIPK5 親緣關系較遠，而與栽培大豆GmCIPK25 基因親緣關系較近。栽培大豆GmCIPK21 基因與野生大豆GsCIPK21 親緣關系較遠，而與野生大豆GsCIPK1_like 基因親緣關系較近(圖3)。

3 討論

Meador 等[34]和Sánchez-Barrena 等[35]指出，擬南芥中CBLs 蛋白含有4 個EF 手結構，這些EF 手結構是CBLs 蛋白結合Ca2＋的位置，對其發揮正常功能十分重要。蛋白結構域預測結果表明，野生大豆10 個CBLs 通路蛋白均含有3 個EF 手結構。通過比較擬南芥與野生大豆的EF 手結構，發現擬南芥和野生大豆的EF1 結構相同，野生大豆EF2 序列較長，包括了擬南芥EF2 和EF3 的序列，野生大豆EF3 與擬南芥EF4結構一致。曹齊衛等[36]對黃瓜(Cucumis sativus)CBLs蛋白結構分析也發現其含有3 個EF 手結構。說明野生大豆可能與黃瓜CBLs 蛋白結構相似。CIPKs 蛋白催化結構域有許多保守的區域，其中最重要的是ATP結合結構域和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性結構域[37]。這兩個結構域分別具有絲氨酸/蘇氨酸激酶特異性和酪氨酸激酶的特異性。除此之外，CIPKs 蛋白的NAF 結構域由25 個氨基酸構成，由其保守的天冬酰胺－丙氨酸－苯丙氨酸(Asn-Ala-Phe)殘基命名，其功能是與CBLs 蛋白相互作用[21]。本研究通過對野生大豆的CIPKs 蛋白結構域基序分析發現，CIPKs 蛋白保守度最高的結構域為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性結構域，其次為ATP 結合結構域，NAF 結構域保守度最低，這與擬南芥中CIPKs 蛋白結構基本一致。

CBLs 蛋白在細胞內的位置受蛋白N－端影響。擬南芥中AtCBL1、AtCBL4、AtCBL5 和AtCBL9 蛋白N－端均含有一小段定位于質膜的N－豆蔻?；Y構域，AtCBL2、AtCBL3、AtCBL6 和AtCBL10 蛋白含有一段延長的N－端結構域，定位在液泡膜上。AtCBL7 和AtCBL8 蛋白由于其N－端結構域突變而定位在細胞質和細胞核中[38]。另外，Oh 等[23]研究指出AtCBL3 定位于細胞質中。由于CIPKs 不含有胞內定位信號，當其獨立存在時可能定位在細胞核、細胞質和質膜上。當CIPKs 與CBLs 互作形成CBL-CIPK 復合體后，CIPKs 的胞內定位則由CBLs 蛋白決定[21，25]。如AtCBL4-AtCIPK24 復合物定位于質膜，AtCBL2-AtCIPK1 定位于液泡膜[32]。本研究通過對野生大豆CBL-CIPK 蛋白的亞細胞定位預測發現，GsCBL1－2、GsCBL3 isoform X1、GsCBL4、GsCBL7、GsCBL9、GsCBL10 和GsCBL10－3 定位于細胞核中，這是野生大豆與擬南芥CBLs 蛋白胞內定位的主要差異，代表了野生大豆的特異性。GsCBL3 定位于細胞質中，與擬南芥中AtCBL3 的胞內定位一致。但這僅是蛋白亞細胞定位的預測結果，野生大豆CBL-CIPK 蛋白在胞內的定位還需試驗證實。

對高耐鹽堿和敏感野生大豆材料在鹽堿脅迫下CBL-CIPK基因轉錄水平進行檢測，重點分析脅迫后同一時間點兩材料間轉錄水平差異的基因。結果發現，兩個野生大豆材料差異表達基因全部集中在脅迫處理后0 h，且高耐鹽堿野生大豆材料中GsCBL10 和GsCIPK10 基因轉錄水平在脅迫處理后0 h 與敏感材料相比均增加。由于0 h 是脅迫處理后立即取樣檢測，故推測耐性野生大豆在受到鹽堿脅迫后CBL-CIPK基因響應十分迅速。余義和等[39]研究了葡萄(Vitis vinifera)在干旱、低溫和鹽脅迫下VvCIPK10 基因的表達量，發現VvCIPK10 受到干旱、低溫和鹽脅迫誘導表達，并且干旱和鹽脅迫后2 h 基因表達量即達到峰值。Kim 等[40]研究發現，擬南芥的 AtCBL10 可與AtCIPK24 直接互作并轉移至液泡膜上，激活液泡膜上AtNHX1(液泡Na＋/H＋逆轉運子)的活性，可介導胞質中的Na＋轉運至液泡中，這對增強擬南芥在鹽脅迫下的耐性有重要作用。高耐鹽堿野生大豆材料中GsCBL10 和GsCIPK10 的上調表達可能受到鹽堿脅迫的誘導，這可能與野生大豆對鹽堿脅迫的抗性有關，但需要進一步試驗證明。

通過對野生大豆與栽培大豆CBL-CIPK基因系統發育分析，發現野生大豆與栽培大豆的CBL-CIPK基因親緣關系較近。但是，野生大豆與栽培大豆在進化上也存在差異，如野生大豆GsCIPK5_like 基因和栽培大豆GmCIPK5 親緣關系較遠，栽培大豆GmCIPK21 基因與野生大豆GsCIPK21 親緣關系較遠。值得注意的是，轉錄組分析表明，高耐鹽堿野生大豆中GsCIPK5_like 基因在鹽堿脅迫后0 h 表達量高達109.88，而敏感材料在同時間點的表達量只有37.12，說明野生大豆GsCIPK5_like 基因受鹽堿脅迫的誘導，其在脅迫后表達量迅速上調可能對野生大豆耐鹽堿脅迫響應較重要。

4 結論

本研究在野生大豆鹽堿脅迫處理轉錄組分析基礎上，鑒定到10 個野生大豆CBLs基因和38 個CIPKs基因。野生大豆CBLs 蛋白均含有3 個EF 手結構，CIPKs 蛋白含有ATP 結合結構域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性結構域和NAF 結構域。CBLs 蛋白主要定位于細胞核中，CIPKs 蛋白定位在細胞質、葉綠體、細胞核、細胞器膜上等。耐性野生大豆CBL-CIPK 通路基因響應鹽堿脅迫主要發生在脅迫處理后0 h，推測野生大豆CBL-CIPK基因響應鹽堿脅迫十分迅速。野生大豆與栽培大豆CBL-CIPK 通路基因親緣關系很近，但存在個別親緣關系較遠的基因。

附表1(續)