膽堿脂肪酸/氨基酸對PEG模擬干旱脅迫下玉米萌發的影響

耿夢瑤 程文聰 陳麗紅 李亞君 陳曉紅

(1西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100；2西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌 712100)

膽堿氨基酸/膽堿脂肪酸離子液體是一類以膽堿作為陽離子，氨基酸/脂肪酸作為陰離子合成的新型離子液體，這類離子液體除了具有較高的熱穩定性和化學穩定性、較強溶解能力、不易揮發以及可設計性等優點外，還具有低毒性和生物可降解性[1]。目前，膽堿類離子液體主要應用于木質纖維素生物質的預處理領域，在秸稈預處理方面具有良好的應用前景[2－3]。Liu等[4]通過簡單、綠色的途徑合成一系列膽堿氨基酸離子液體，發現大多數膽堿氨基酸離子液體能有效溶解木質素；此外，用膽堿類離子液體處理小麥、水稻秸稈時能有效提高酶解效率，且離子液體可重復利用，但隨著回收次數的增多，其回收率降低，對木質素的萃取效果變差，從而不得不將之廢棄。因此，要實現秸稈預處理過程中離子液體綠色高效循環利用，殘液的合理處理和利用十分重要。

遲曉麗[5]將秸稈預處理后的殘液用于盆栽番茄，結果發現膽堿脯氨酸處理殘液對番茄的生長發育具有促進作用，能有效提高番茄植株的抗病能力，這為殘液的重復利用提供了綠色有效的新途徑，同時拓展了膽堿類離子液體在農業生產方面的利用。膽堿類離子液體中的陽離子膽堿是一種廣泛存在于動植物體內，用于合成細胞膜等結構的季胺類物質，具有維持細胞膜結構完整性，促進質膜流動及提高生物膜選擇透性等生理功能[6]，同時膽堿也是滲透調節物質——甘氨酸甜菜堿合成的初始底物。研究發現，干旱脅迫下玉米幼苗中的膽堿含量大幅度增加，并誘導甘氨酸甜菜堿的大量積累，調節干旱引起的滲透脅迫[7]。另外，膽堿類離子液體中的陰離子氨基酸和短鏈脂肪酸在作物生長和抗逆方面也發揮著重要作用。氨基酸可以緩解非生物脅迫造成的損傷，同時也可作為植物激素的前體物質調節作物的生長[8－9]。外源天冬氨酸、谷氨酸能顯著降低滲透脅迫下蕎麥葉片質膜透性和MDA 含量，顯著提高抗氧化酶活性[10]。同時，Wu 等[11]研究了膽堿氨基酸離子液體對水稻種子萌發和根長的影響，結果表明，膽堿天冬氨酸能促進水稻種子萌發和根長的生長，有望用作水稻的生長促進劑。此外，膽堿類離子液體作為一種新型的離子液體，與傳統的離子液體相比表現為更低的毒性，傳統的離子液體如咪唑類離子液體在作物生長方面已有較多的研究，其能通過改變植物細胞結構，降低光合作用、抗氧化酶活性，改變激素代謝水平，如促進衰老相關激素(乙烯和脫落酸)的生物合成，以及生長促進激素(赤霉素)的失活等來影響作物幼苗的生長發育，且離子液體的毒性隨烷烴鏈的增加而增加[12－17]。而目前關于膽堿類離子液體對作物生長影響的研究較少，且關注點尚且停留在離子液體對作物正常生長的影響方面。

本試驗在前期研究的基礎上分別挑選2 種膽堿脂肪酸和4 種膽堿氨基酸離子液體，研究聚乙二醇－6000(polyethylene glycol－6000，PEG)模擬干旱脅迫下膽堿類離子液體浸種處理對玉米種子萌發與根芽生長的影響，旨在為探究膽堿類離子液體影響作物生長以及對作物抗旱性方面的生理機制提供理論基礎，拓展膽堿類離子液體在農業領域的利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試玉米種子品種為鄭單958，購自北京德農種業。氫氧化膽堿(46%)購自美國Sigma 公司；氨基酸和脂肪酸購自北京百靈威科技有限公司。

1.2 離子液體的合成

在前人合成離子液體的方法上稍加改進[2，18]。在常溫下，按照2 ∶1 摩爾比，將氫氧化膽堿水溶液(46%)逐滴加入己二酸、辛二酸水溶液中；氫氧化膽堿與蘇氨酸、纈氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺按1 ∶1摩爾比的劑量滴加。整個過程在磁力攪拌器上進行，每次滴加少量，確保充分混勻。滴加完成后，在搖床反應48 h(18℃，200 r·min－1)，反應完成后溶液pH 值在7.0～9.0 之間，在55℃條件下旋轉蒸發除去水分，然后將所得液體于55℃真空干燥48 h，即得膽堿脂肪酸/氨基酸離子液體，室溫下為淺黃色至黃色液體。以氘代水為溶劑，采用AVANCEⅢ400 MHz 核磁共振光譜儀(德國Bruker 公司)測定離子液體的氫譜，并進行譜圖分析，表征所合成離子液體的結構，確認所合成離子液體的正確性。

1.3 試驗設計

經過前期篩選，選用4 種膽堿氨基酸(膽堿纈氨酸、膽堿蘇氨酸、膽堿天冬氨酸、膽堿天冬酰胺)和2種膽堿脂肪酸(膽堿己二酸、膽堿辛二酸)進行浸種處理。選取大小均勻，健康飽滿的玉米種子，用75%乙醇消毒5 min，然后用蒸餾水沖洗干凈。分別用200 mg·L－1膽堿氨基酸、膽堿脂肪酸和蒸餾水浸種12 h，以蒸餾水浸種作為對照。之后，將浸種后的種子在發芽盒中萌發，并使用PEG－6000 模擬干旱脅迫，具體方法如下:在發芽盒(長×寬×高:19 cm×13 cm×12 cm)底部鋪有雙層濾紙，PEG 模擬干旱脅迫處理使用30 mL 13% PEG 溶液(13% PEG 濃度根據前期預試驗確定，屬于中等程度脅迫)浸濕濾紙，將不同膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種后的種子整齊放置于濾紙上萌發。同時，將蒸餾水浸種處理的對照種子分為2 組，一組為蒸餾水對照(CK－蒸餾水)，另一組為PEG 對照(CKPEG)(干旱脅迫處理方法同上)。每個發芽盒中放置25 粒種子，每處理3 次重復，進行2 次重復試驗。種子萌發于28℃恒溫培養箱(黑暗)內進行。每隔24 h記錄一次發芽數，連續記錄5 d，計算玉米種子的發芽率、發芽勢以及發芽指數。5 d 后，每盒取6 顆幼苗測定根長、芽長；并剝取完整的種胚進行后續幼胚可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、過氧化氫(H2O2)含量等生理指標的測定。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 萌發參數 根據公式計算發芽率、發芽勢和發芽指數:

發芽率＝供試種子發芽數/供試種子總數×100%

發芽勢＝3 d 內供試種子的發芽數/供試種子總數×100%

發芽指數＝ΣGt/Dt

式中，Gt 為第t 天的發芽數，Dt 為相應的發芽天數。

1.4.2 玉米種胚生理指標 本研究所測定的酶活性用比活力表示，即每毫克可溶性蛋白所含的酶活力單位?？扇苄缘鞍缀康臏y定采用考馬斯亮藍G250 染色法[19]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定采用氮藍四唑(nitroblue terazolium，NBT)光還原法[19]；過氧化物酶(peroxidase，POD)活性測定采用愈創木酚法[20]；過氧化氫酶(catalase，CAT)活性、MDA 含量測定參照高俊鳳[21]的方法；H2O2含量測定采用硫酸鈦法[21]。

1.5 數據分析

數據統計分析采用單因素方差分析LSD 法進行。數據統計分析使用R 軟件(版本:3.6.1)“agricolae”程序包完成。

2 結果與分析

2.1 膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種對PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子萌發的影響

由圖1和表1可知，PEG 模擬干旱脅迫顯著降低了玉米種子的發芽勢、發芽率和發芽指數，而部分膽堿類離子液體浸種有利于緩解干旱脅迫對玉米種子萌發的抑制作用。膽堿己二酸、膽堿辛二酸浸種處理后，干旱脅迫下玉米種子的發芽指數相比CK-PEG 處理分別提高了42.6%、40.2%，差異顯著，而種子的發芽勢、發芽率提高不顯著。4 種膽堿氨基酸浸種處理后，玉米種子的3 個萌發參數均高于CK-PEG 處理，其中，膽堿天冬氨酸、膽堿天冬酰胺浸種處理后種子的發芽勢均顯著提高至75.0%。

表1 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸離子液體對PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子萌發參數的影響Table 1 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acid ILs on seed germination parameters of maize under PEG simulated drought stress

圖1 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種對PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子萌發的影響Fig.1 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs soaking on seed germination of maize under PEG simulated drought stress

2.2 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種對PEG 模擬干旱脅迫下玉米萌發后根芽生長的影響

由表2可知，PEG 模擬干旱脅迫嚴重抑制了玉米種子萌發后根芽的生長，膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種處理能緩解PEG 模擬干旱脅迫對玉米根芽生長的抑制作用。相比CK-PEG 而言，PEG 模擬干旱脅迫下膽堿己二酸、膽堿辛二酸離子液體浸種處理的玉米芽長分別增加24.9%、22.9%，根長分別增加4.2%、11.7%；膽堿天冬氨酸、膽堿天冬酰胺浸種處理后玉米根芽生長均顯著增加，芽長分別增加46.1%、40.3%，根長分別增加26.7%、13.8%。

表2 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸離子液體對PEG 模擬干旱脅迫下玉米萌發后根芽生長的影響Table 2 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs on the growth of maize root and shoot under PEG simulated drought stress

2.3 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種對PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，與CK－蒸餾水相比，PEG 模擬干旱脅迫顯著降低了玉米種胚中抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性。PEG 模擬干旱脅迫下，膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸離子液體浸種處理有利于提高玉米種胚的抗氧化酶系活性。與CK-PEG 相比，膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種有利于提高SOD 活性，其中膽堿天冬酰胺處理的SOD 活性顯著提高了41.2%。膽堿類離子液體浸種總體顯著提高PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚POD 和CAT 活性；在2 種膽堿脂肪酸離子液體中，膽堿辛二酸浸種處理的POD 活性較CK-PEG 提高了108.5%；4 種膽堿氨基酸離子液體浸種處理中膽堿纈氨酸、膽堿蘇氨酸處理的POD 活性較CK-PEG 分別提高了108.7%、120.3%；活性膽堿纈氨酸、膽堿天冬氨酸浸種處理的CAT 活性較CK－PEG 分別提高了121.9%、117.2%。

圖2 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種對PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚抗氧化酶活力的影響Fig.2 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs soaking on antioxidant enzyme activities of maize embryo

2.4 膽堿脂肪酸和氨基酸浸種對PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚MDA、H2O2 含量的影響

由圖3可知，PEG 模擬干旱脅迫導致玉米種胚中MDA 和H2O2含量顯著增加。與CK-PEG 相比，膽堿類離子液體浸種處理后玉米種胚中MDA、H2O2含量均顯著下降。其中，膽堿己二酸、膽堿辛二酸浸種處理后，玉米種胚中MDA 含量分別降低了42.8%、47.3%；膽堿纈氨酸、膽堿天冬酰胺浸種處理后，種胚中MDA含量分別降低了45.6%、51.3%；膽堿纈氨酸、膽堿天冬酰胺浸種處理后，種胚中H2O2含量分別降低了42.5%、29.8%。

圖3 膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種對PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚MDA 和H2O2 含量的影響Fig.3 Effects of cholinium fatty acids and cholinium amino acids ILs soaking on MDA and H2O2content of maize embryo

3 討論

發芽率、發芽勢和發芽指數是衡量植物種子萌發表現的重要指標，干旱脅迫下種子的發芽勢、發芽率等顯著降低，使種子萌發受到明顯的抑制，而外源生長調節劑或激素浸種能有效緩解干旱脅迫對種子萌發的抑制作用[22－23]。同時，前人關于離子液體對作物生長的研究也提出，低濃度的離子液體可促進作物的生長，其作用類似于植物生長調節劑[24－25]。在本研究中，膽堿己二酸、膽堿辛二酸、膽堿天冬氨酸和膽堿天冬酰胺浸種處理能顯著提高PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子的部分萌發參數，緩解PEG 模擬干旱脅迫對玉米種子萌發的抑制作用，并有效促進PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子萌發后玉米根芽的生長，這與外源生長調節劑的作用存在相似性；另外，在本研究PEG 模擬干旱脅迫下，膽堿類離子液體浸種處理后種子的發芽率增加不顯著的原因可能是試驗所用種子活力較高，所以導致浸種處理后種子發芽率與CK-PEG 處理相比差異不顯著。

植物在遭受生物或非生物脅迫后，可造成活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量積累，導致氧化脅迫的產生。植物體內的抗氧化酶系統(如SOD、POD、CAT 等)在清除活性氧方面發揮著重要作用，且這些酶的作用是高度專一的[26－27]。SOD 將轉化為O2和H2O2[28]，而POD、CAT 將H2O2分解為O2和H2O，這些酶的相互關聯依次將植物體內的ROS 轉化為無毒物質。本研究中，PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚中抗氧化酶活性顯著降低，模擬干旱脅迫下，與CKPEG 相比，膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種處理的玉米種胚中抗氧化酶活性的總體趨勢為部分處理下SOD活性顯著提高，所有膽堿類離子液體浸種處理POD 活性均顯著增加，且除膽堿蘇氨酸外，所有膽堿類離子液體浸種處理CAT 活力均顯著增加，可見，本研究考察的膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種有利于提高模擬干旱脅迫下抗氧化酶活性。本研究還發現，與CK-PEG 相比，所有膽堿類離子液體浸種處理均顯著降低了干旱脅迫下種胚中的H2O2含量，這與不同膽堿類離子液體浸種下較高的POD、CAT 活力是相符的。MDA 含量在一定程度上反映細胞內脂質過氧化水平和細胞損傷程度。與CK-PEG 相比，膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種處理能顯著降低PEG 模擬干旱脅迫下玉米種胚的MDA 含量，緩解了PEG 模擬干旱脅迫對玉米種子的氧化損傷。

4 結論

本研究結果表明，利用膽堿脂肪酸和膽堿氨基酸浸種有利于緩解PEG 模擬干旱脅迫對玉米種子萌發的抑制作用，這可能與不同膽堿浸種處理下玉米種胚抗氧化酶活性提高，MDA、H2O2含量降低有關。使用本研究中考察的不同膽堿氨基酸和膽堿脂肪酸浸種有助于提高PEG 模擬干旱脅迫下玉米種子的萌發指標及萌發后種子根、芽的生長狀況。