藍萼甲素對牙齦卟啉單胞菌體外抑菌活性研究

楊鈺婷 宋忠臣 張旭 周薇 周魯先 宋莉

牙周炎是一種微生物相關的、宿主介導的、多因素參與并導致牙周附著喪失的炎癥性疾?。?］。藥物治療是牙周炎的一種輔助治療方式，目前最常用于臨床的藥物主要是一些抗生素類藥物，如：甲硝唑、阿莫西林等，它們主要通過抑制某些特定種類的細菌及細菌復合物發揮其輔助治療的效果［2］。但近些年來，抗生素耐藥性問題已經被認為是人類健康的主要風險，而且相關研究人員已經從感染的牙髓組織和牙周組織中分離出多種耐藥菌株［3］，這表明口腔很可能作為耐藥菌菌庫，限制抗生素在治療身體其他部位的感染性疾病中的有效性［4］。為了減少牙周病原菌的耐藥性問題，研究人員正致力于研究各種新型的牙周炎輔助治療方法，包括益生菌療法［5］、激光療法［6］等。與此同時，有研究表明基于天然化合物的治療方法能有效抑制口腔中致病微生物的定植和生長，并且有的天然化合物在體外抗菌實驗中還能夠達到抑制口腔生物膜形成和減少口腔中成熟生物膜的作用［7］，這就提示若將天然化合物用于牙周炎治療可能在不造成耐藥性問題的基礎之上達到有效控制牙周病發展的效果。因此有越來越多的牙周炎藥物研究開始將目光聚焦于具有較高安全性以及廣泛生物學活性的天然化合物。

藍萼甲素（glaucocalyxin A，GLA）是從唇形科香茶菜屬植物藍萼香茶菜中分離并提取出來的一種天然化合物，屬于對映－貝殼杉烷型二萜類化合物［8］，具有抗氧化活性、抗腫瘤活性、抗凝血及抗血栓活性、免疫活性、抗炎性以及抗菌活性［9］。但目前尚無關于GLA針對牙周致病菌的體外抗菌實驗研究。

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis）是牙周病、尤其是慢性牙周炎病變區或活動部位最主要的優勢菌，相關研究顯示P.gingivalis在慢性牙周炎患者齦下菌斑中的檢出率高達85.75%［10］。P.gingivalis能從齦溝或牙周袋內的上皮細胞侵入宿主的牙周組織中，釋放各種毒素，誘導宿主產生一系列炎癥反應。毒素的作用加之機體自身的免疫炎癥反應將導致宿主牙周支持組織的吸收和破壞，最終使得牙齒松動、脫落。除此之外，P.gingivalis還能夠逃避宿主的免疫防御，這一特點使得由P.gingivalis所導致的牙周組織的感染和破壞很難得到有效的控制［11］。因此，在與牙周炎相關的體外抑菌實驗中常將P.gingivalis作為實驗對象來觀察和研究不同處理方式對牙周致病菌的作用［12－14］。

本研究觀察GLA對P.gingivalis的生長及其生物膜的形成和生物活性的影響，初步探究GLA作為一種抗菌藥物用于輔助治療牙周炎的可行性。

1 材料與方法

1.1 基本材料

藍萼甲素溶液（上海艾濟生物科技有限公司）；P.gingivalis ATCC 33277（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔微生物實驗室）；腦心浸液（BHI）培養基、培養液（BD，美國）；厭氧培養箱（Baker，英國）；酶標儀（Bio Tek Epoch2，美國）；結晶紫染料（Sigma，美國）；MTT試劑盒（上海碧云天）。

1.2 研究方法

1.2.1 細菌培養及鑒定 取凍存的 P.gingivalis ATCC 33277菌株于超凈臺中常規接種復蘇。復蘇成功后取適量菌液以四區劃線法均勻涂布于BHI瓊脂平板上，將平板倒置放入37℃恒溫厭氧箱中厭氧培養72 h。待平板上形成形態均一的黑色菌落后，挑取其中部分單克隆菌落進行革蘭氏染色，并在光學顯微鏡下根據P.gingivalis的形態學特點對復蘇的菌株進行鑒定，鑒定無誤后，挑取若干單克隆菌落接種至BHI液體培養基中進行增菌培養。

1.2.2 GLA對 P.gingivalis的藥物敏感性實驗 取培養至對數生長期的P.gingivalis，用BHI培養基將菌液濃度調整至約2.0×107CFU/mL，備用。

實驗組為用BHI培養基稀釋好的GLA與備用的菌液各100μL加入96孔板中混合，使其中GLA的終濃度分別為：1.25、2.5、5、10μmol/L，菌液的終濃度為1.0×107CFU/mL。對照組為菌液加BHI培養基，菌液終濃度同實驗組。另設調零孔（200μL BHI培養基）用于實驗組和對照組的調零。每組至少設置三副孔。

將上述配置好的孔板放入37℃恒溫厭氧箱中厭氧培養48 h后，用酶標儀讀取各組在600 nm波長時的吸光度值（A值）。將A600＜0.05所對應的最小濃度定為GLA對P.gingivalis的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）［15］。各實驗組的生長抑制率（%）＝［（對照組A600－調零孔A600）－（實驗組A600－調零孔 A600）］/（對照組 A600－調零孔 A600）×100%。實驗至少重復3次。

各組取適量菌液涂布于BHI瓊脂血平板上，將平板倒置放入37℃恒溫厭氧箱中厭氧培養48 h，將觀察到菌落數量為0的最小濃度定為GLA對P.gingivalis的最小殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）。

1.2.3 GLA對 P.gingivalis生物膜形成的影響 實驗組按照 GLA終濃度分為：1/4 MIC（1.25μmol/L）、1/2 MIC（2.5μmol/L）、MIC（5μmol/L），對照組培養基中不加入GLA，具體處理過程同1.2.2。將配置好的96孔板放入37℃恒溫厭氧箱中厭氧培養48 h后取出，將孔板內多余液體棄去，用PBS輕輕沖洗3次，注意沖洗過程盡量小心輕柔不要破壞生物膜的完整性。然后往孔板內加入甲醇固定生物膜15 min，棄甲醇。待96孔板干燥后，往每孔中加入0.4%的結晶紫（crystal violet，CV）溶液染色15 min，棄染料，將多余染料沖洗干凈，待96孔板充分干燥后，每孔加入100μL 95%乙醇溶液，另設調零孔，調零孔內只加100μL 95%乙醇溶液。蓋上蓋板輕輕震蕩1 h，最后用酶標儀在波長550 nm處讀取 A值［16］。

1.2.4 GLA對P.gingivalis生物膜的代謝活性的影響分組及處理同1.2.3，將配置好的96孔板放入37℃恒溫厭氧箱中厭氧培養48 h后取出，將孔板內多余液體棄去，用PBS輕輕沖洗3次，然后往孔板內加入0.5%MTT 50μL，厭氧避光孵育4 h后棄去孔內液體，加入100μL DMSO進行溶解，另設調零孔，調零孔內只加100μL DMSO。輕輕震蕩10 min后用酶標儀在波長490 nm處讀取A值。

1.3 統計學方法

使用Graphpad Prism 6.0軟件對實驗數據進行統計學分析。定量資料采用±s表示。采用單因素方差分析法進行數據統計分析，P＜0.05表示差異有統計學差異。

2 結 果

2.1 GLA對P.gingivalis的藥物敏感性實驗

如表1所示，當GLA濃度達到5μmol/L時，其所對應的 A600＝0.024±0.008，是 A600＜0.05所對應的最小濃度，故GLA對P.gingivalis的MIC為5μmol/L；在此濃度下有P.gingivalis細菌懸液中96%的細菌生長受到抑制（圖1）。當GLA濃度達到1/2 MIC即2.5 μmol/L時，與對照組相比 P.gingivalis細菌懸液的生長已受到顯著的抑制效果（P＜0.05）（表1），此時GLA對P.gingivalis細菌懸液的生長抑制率已達61%（圖1）。雖然 10μmol/L GLA對 P.gingivalis細菌懸液的生長抑制率高達99%，但與5μmol/L組相比其差異并無統計學意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 不同濃度GLA對P.gingivalis細菌懸浮液生長的相對抑制率（與對照組相比，*P＜0.000 1）Fig 1 Relative inhabitation rate of GLA on P.gingivalis bacterial planktonic cultures（compared with control group，*P＜0.000 1）

表1 不同濃度GLA對P.gingivalis細菌懸浮液A值的影響 （±s）Tab 1 The effects of different concentrations of GLA on the A value of P.gingivalis bacterial planktonic cultures（±s）

表1 不同濃度GLA對P.gingivalis細菌懸浮液A值的影響 （±s）Tab 1 The effects of different concentrations of GLA on the A value of P.gingivalis bacterial planktonic cultures（±s）

注：與對照組比較，① P＜0.05

分組 對照組 實驗組（μmol/L）1.25 2.5 5 10 A600 0.554±0.015 0.520±0.062 0.126±0.037① 0.024±0.008① 0.021±0.006①

如圖 2所示，當 GLA濃度為 2.5μmol/L和 5 μmol/L時，P.gingivalis在 BHI瓊脂血平板上的生長情況與對照組無明顯差異。當GLA濃度為10μmol/L時，與對照組相比P.gingivalis的生長受到顯著抑制，只在劃線的起始部分觀察到明顯的成群的菌落，隨著劃線往后菌落數量也隨之減少，并且菌落密度也越來越低，甚至在劃線的末端已未見有明顯的黑色菌落形成。當GLA的濃度達到20μmol/L時，BHI瓊脂血平板上的該區域內未見有P.gingivalis菌落生長和形成，菌落數為 0，故 GLA對 P.gingivalis的 MBC為 20 μmol/L，為 MIC值的4倍。

圖2 不同濃度GLA對P.gingivalis在BHI瓊脂血平板上的生長情況的影響Fig 2 The effect of different concentrations of GLA on the growth of P.gingivalis on BHI agar blood plate

2.2 GLA對P.gingivalis生物膜形成的影響

圖3所示，當 GLA濃度達到1/4 MIC即1.25 μmol/L，GLA對 P.gingivalis生物膜的形成已經具有具有顯著抑制作用（P＜0.01），與對照組相比能夠抑制 14%P.gingivalis生物膜的形成，而 1/2 MIC（2.5 μmol/L）的 GLA能抑制25%P.gingivalis生物膜的形成。當 GLA濃度升高到 MIC（5μmol/L），其對P.gingivalis生物膜形成的抑制作用進一步增強，能抑制76%P.gingivalis生物膜的形成。結果表明，GLA對P.gingivalis生物膜的形成過程具有一定的抑制作用，并且該抑制作用隨著GLA濃度的升高而增強，呈濃度依賴性變化。

圖3 結晶紫染色法檢測不同濃度GLA對P.gingivalis生物膜形成的影響（*P＜0.01，**P＜0.000 1）Fig 3 The effect of different concentrations of GLA on the formation of P.gingivalis biofilm examined by crystal violet staining（*P＜0.01，**P＜0.000 1）

2.3 GLA對P.gingivalis生物膜代謝活性的影響

圖 4示當 GLA濃度達到1/4 MIC（1.25μmol/L），P.gingivalis生物膜代謝活性開始受到抑制（P＜0.01），此時有20%的生物膜代謝活性受到抑制；當GLA的濃度上升到 1/2 MIC（2.5μmol/L）時，能抑制38%P.gingivalis生物膜的代謝活性；MIC（5μmol/L）時已有74%的生物膜代謝活性受到抑制（P＜0.000 1）。不同濃度的實驗組之間的差異均存在統計學意義（P＜0.05），說明 GLA對 P.gingivalis生物膜的代謝活性的抑制作用呈濃度依賴性，抑制作用從1.25μmol/L開始隨著GLA濃度的升高而不斷增強。

圖4 MTT法檢測不同濃度GLA對P.gingivalis生物膜生物活性的影響（與對照組相比，*P＜0.01，**P＜0.000 1）Fig 4 The effect of different concentrations of GLA on the viability of P.gingivalis biofilm examined by MTT assay（compared with control group，*P＜0.01，**P＜0.000 1）

3 討 論

藥物治療雖然是治療牙周炎的一種輔助手段，但在牙周組織的急性感染、器械不易到達的感染部位以及伴有全身性疾病的患者或不能行使口腔衛生措施的患者等特殊情況下往往能發揮非常重要的作用。鑒于目前抗生素的使用存在著諸如耐藥性等在內的一系列問題［17］，天然化合物的使用已經逐漸成為了研究的熱點，越來越多的證據表明一些天然化合物能夠對包括P.gingivalis在內的牙周致病菌的細菌懸液及生物膜產生抑制作用［18－20］。

GLA是一種提取自藍萼香茶菜的天然化合物，具有良好的生物活性和較高的生物安全性，其抗菌活性很早就被人們發現和研究。早在1954年，就有日本學者發現從香茶菜中提取出來的對映－貝殼杉烷型二萜類化合物具有抑制革蘭氏陽性細菌生長的作用。后來又有中國學者發現：藍萼香茶菜的莖和葉的乙醇提取物對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌表現出較好的抑菌活性，莖和葉的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的MIC分別為 25 mg/mL和 50 mg/mL［21］。金忠民等［22］的實驗結果則顯示藍萼香茶菜提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用，并且采用不同的提取劑其MIC也不一樣。在上述實驗中研究的藍萼香茶菜提取物其實是藍萼香茶菜的一種粗提取物，其中除了含有主要的活性成分GLA之外還有一些其他的化學成分。目前尚無針對分離純化后的GLA的抗菌活性的相關研究，本實驗是首次將分離純化的GLA用于體外抗菌實驗。

MIC的定義為：在特定時間段內肉眼能觀察到的抑制微生物生長的最小藥物濃度，MIC實驗的金標準包括微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法，本實驗在微量肉湯稀釋法的基礎之上采用酶標儀在特定波長下測定A值的方法來判定GLA的MIC值，這種方法較大多數實驗所采用的肉眼判讀方法更為客觀和準確［12］。實驗結果顯示GLA對P.gingivalis的 MIC為5μmol/L（約1.66μg/mL），遠小于上述實驗中用藍萼香茶菜提取物所測得的MIC，這一結果一方面證明了GLA具有良好的抗菌活性，另一方面還提示了GLA很可能就是藍萼香茶菜提取物中發揮主要抗菌作用的活性成分。采用分離純化后的GLA，排除了其他化學成分可能對實驗結果產生的影響，從而使得本實驗的最終結果更加的具體、準確，更具說服力，并且對于后續研究及實際臨床運用更具參考價值和指導意義。

牙周致病微生物在口腔中往往是以生物膜的形式存在的。細菌生物膜的特殊結構使得其既不能被水沖去或漱掉，同時也使得其中的細菌能夠抵抗表面活性劑、抗生素或宿主防御功能的殺滅作用。相關研究顯示，細菌生物膜的基質能夠阻止抗生素進入嵌入其中的細菌細胞，所以即使抗生素能夠通過物理作用在生物膜表面流動也無法穿透生物膜基質發揮其殺菌作用［23］。本實驗采用結晶紫染色法來進行生物膜的敏感性實驗，這是生物膜檢測的一種標準方法［24］，即用結晶紫染料對生物膜成分進行染色，使生物膜中的活細胞、死細胞以及生物膜基質染色，然后再通過染色的深淺程度來對生物膜進行量化分析，相關證據表明此法的檢出率優于其他生物膜檢測方法。MTT實驗的實驗原理是利用活細胞中的琥珀酸脫氫酶將外源性的MTT還原為不溶于水的紫色結晶狀甲臜（Formazan），甲臜能夠溶解于二甲亞砜（DMSO），溶解后能夠用酶標儀對其進行定量分析［25］。MTT實驗雖然常常用于細胞毒性的檢測試驗，但實際上它同樣可以運用于微生物實驗，如：多重耐藥菌的檢測試驗、生物膜形成的測定實驗以及抗菌化合物的間接定量檢測實驗等，與結晶紫染色實驗相比，MTT實驗除了能夠對生物膜進行定位和定量分析之外，最主要的是能夠反映生物膜中活細菌的存在，從而能夠對生物膜的代謝活性進行定量的分析，是對結晶紫染色實驗的補充和延伸。本實驗結果顯示GLA對P.gingivalis生物膜的形成過程及其生物學活性均具有抑制作用，當GLA濃度達到對P.gingivalis浮游菌具有顯著抑制作用的MIC值時，其對P.gingivalis生物膜的形成和代謝活性也同樣有較為顯著的抑制作用。GLA的這一特性能夠使其在抑制牙周致病菌生長的同時還能夠有效防止細菌粘附和定植，阻止其在口腔中形成生物膜，從而進一步阻止牙周致病菌對牙周組織的的損害。

綜上所述，本實驗證明GLA作為一種天然化合物，對P.gingivalis有較好的抑菌效果，并且還能夠有效抑制P.gingivalis生物膜的形成及代謝活性，加之其較高的生物安全性及較好的抗炎活性［26］，GLA有望成為牙周炎輔助治療的一種新型藥物，在防止牙周致病菌的定植、抑制口腔生物膜的形成和生長及減輕牙周組織炎癥反應等方面發揮作用。