超聲波、NaCl脅迫及協同處理對苦蕎麥萌發、生理變化及抗氧化性的影響

王思蒙，黃閩鳳，許先猛，王順民，陳 明

(安徽工程大學 生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000)

苦蕎麥(

Fagopyrum

Tataricum

Gaertn.

)作為雙子葉蕎麥屬植物，富有營養和醫藥價值，一直被公認為“藥食兩用”的優秀農作物之一?？嗍w麥含有其他主要作物所缺乏的黃酮等藥用成分，能預防和治療多種疾病，近年來，人們對其的利用產生了新的興趣。

超聲波技術是一種通過安全高效的物理刺激，改善植物性食物如麥苗、豆芽的食用性和營養質量的一種新方法，已被廣泛應用到農業領域。有報道稱，在0～300 W超聲波處理后，大豆的萌發率以及芽苗中的GABA (γ-aminobutyric Acid)、大豆甙元(Daidzein)和染料木黃酮(Genistein)的含量顯著提高，但大豆異黃酮(Isoflavone)、黃豆苷(Daidzin)和染料木苷(Genstin)含量顯著下降。大麥種子經52～414 W超聲波處理3～15 min后，其萌發率增加1.042～1.065倍，發芽時間縮短30%～45%。此外，還有報道稱，超聲波處理可以通過增強過氧化氫酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)等抗氧化酶的活性來緩解重金屬給植物造成的毒害作用。

NaCl脅迫處理會影響種子的萌發、生長發育和滲透調節，促進植物體內一些活性物質的積累，但也可能會抑制植物組織和器官的生長。有報道稱，蕎麥、小麥和玉米在NaCl脅迫下其幼苗中CAT、SOD、POD和PPO的活性顯著提高而丙二醛(MAD)的含量顯著降低。有研究表明NaCl脅迫會使大麥芽苗中脯氨酸和可溶性蛋白等成分含量上升，并且低濃度的NaCl溶液對大麥種子的處理效果比高濃度的好。有研究表明10～200 mM NaCl的處理使苦蕎芽苗中的總酚類化合物增加57%～153%，50 mM和100 mM NaCl處理的芽菜類胡蘿卜素含量比對照組高出2倍。適當濃度NaCl的處理改善了幼芽的營養質量，包括酚類化合物、類胡蘿卜素和抗氧化活性的水平。

目前關于超聲波、NaCl脅迫處理對谷物萌發影響的報道較多，但是超聲波協同NaCl脅迫處理對谷物種子的萌發及活性成分含量的影響報道較少。研究采用超聲波、NaCl溶液，超聲波協同NaCl溶液對苦蕎麥種子進行處理，探索上述方法對苦蕎麥萌發及生理生化指標(萌發勢、黃酮含量、總酚含量等)的影響，從而為進一步提高苦蕎的利用價值提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 原料

苦蕎麥，購自寧夏鹽池種子公司。

1.2 實驗方法

(1)預處理。選擇粒大、飽滿的苦蕎麥種子清水洗凈，置于1.0 g/L高錳酸鉀溶液浸泡10 min后洗至澄清。于25 ℃恒溫培養箱中浸泡4 h，期間換1次水。后置于45～55 ℃的水中催芽15 min，后分若干份，每份150～180粒備用。

(2)超聲波及NaCl脅迫處理。①超聲波處理：取出3份經預處理過的種子置于盛著水的燒杯中，在29 ℃下，分別采用功率為240 W、280 W、320 W的超聲波處理30 min(即T、T和T處理：U240 W/30 min+W(T)，U280 W/30 min +W(T)，U320 W/30 min + W(T))，瀝水，培養。②NaCl溶液處理：取出3份經預處理過的種子置于2.5 mmol/L、5.0 mmol/L和7.5 mmol/L的NaCl溶液培養(即T、T和T處理)。③超聲波協同NaCl溶液處理：取出3份經預處理過的種子置于超聲波處理器中，在功率為320 W，溫度為29 ℃下處理30 min，瀝水，再分別置于2.5 mmol/L、5.0 mmol/L和7.5 mmol/L的NaCl 溶液中培養(即T、T和T處理)。另取出2份種子置于超聲波處理器中，在功率為320 W，溫度為29 ℃的條件下，分別處理20 min和10 min(即T和T處理)，瀝水，再置于5.0 mmol/L的NaCl 溶液培養。同時做對照實驗(未經超聲波、NaCl溶液處理，對照組)。

(3)培養。將上述不同處理的種子均勻平鋪在內襯雙層濾紙的直徑為10 cm的培養皿中，后移至種子培養箱中，于溫度25 ℃，濕度為80%的條件下進行避光培養，每隔12 h補充一次溶液(其中T～T組補充蒸餾水，T～T組補充對應濃度的NaCl溶液)，每隔24 h統計一次萌發種子數，7 d后取長勢均勻的芽苗進行稱重、研磨，作為待測樣品，測定各指標。

1.3 測定指標

(1)萌發率。自開始培養起，每隔12 h依次測量其萌發率(胚軸突破種皮1 mm即為萌發)，連續測定7 d，每組重復3次，直至達到預期的時間或個別處理組萌發率達到100%。采用游標卡尺分別測定其芽長和根長。

(2)過氧化物酶和超氧物歧化酶活性。取0.3 g苦蕎芽苗樣品洗凈后置于預冷的研缽中，加入(2～3 mL)50 mmol/L預冷的pH 7.8的磷酸鈉緩沖液(含1%PVP，0.1%疏基乙醇)和少量石英砂在冰浴上研磨成勻漿，在4 ℃、1 2000 g下離心20 min，上清液即為POD、SOD的粗酶液。POD活性的測定采用愈創木酚法，SOD活性的測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法。

(3)丙二醛。稱取0.3 g苦蕎芽苗，加入2 mL 10%TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8 mL TCA進一步研磨，勻漿離心(4 000 r/min)10 min，上清液為樣品提取液。根據Jain稍作改進之后采用硫代巴比妥酸法測定MDA濃度。吸取2 mL提取液于試管中(對照管加2 mL蒸餾水)，各加入2 mL 0.6%(硫代巴比妥酸)TBA，混勻后，試管加蓋塞，置于沸水浴中煮15 min，冷卻，以4 000 r/min離心15 min，取上清液測定532 nm和450 nm以及600 nm的吸光度。

MDA濃度(umol/L)=6.45×(

D

532-

D

600)0.56×

D

450。

(4)還原糖。采用3,5—二硝基水楊酸法。取一定量的苦蕎麥芽，加少量蒸餾水攪勻，置于50 ℃恒溫水浴20 min，經過兩次離心或過濾，取上清液進行還原糖測定。還原糖含量按式(1)計算：

(1)

式中,

C

為標準曲線方程求得的還原糖的量(mg)；

V

為提取液的體積(mL)；

a

為顯色時吸取樣品液的體積(mL)；

W

為樣品重(g)。

(5)總黃酮。將一定量的苦蕎麥芽置于研缽中，加少量石英砂，加入60%的乙醇進行研磨、提取，提取液用冷凍離心機在9 000 r/min下離心15 min，以離心后的上清液為樣液，準確吸取0.5 mL樣液于10 mL容量瓶。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量。

(6)總酚。稱取(0.200 0±0.000 5)g樣品凍干粉，加入5 mL 70%甲醇溶液，60 ℃超聲處理(240 W/30 min)，提取2次，8 000 r/min離心10 min，過濾備用。采用Folin-酚法測定總酚的含量。

(7)DPPH清除能力。取苦蕎麥芽苗乙醇提取液(60%乙醇，定容至50 mL)0.2 mL，加入7.8 mL濃度為0.025 mLDPPH乙醇溶液，立即混勻，在一定時間間隔內(10 min)測定其在517 nm處的吸光度。按式(2)計算：

(2)

式中,

A

為原始溶液的吸光值；

A

為參比溶液的吸光值；

A

為待測溶液的吸光值。

1.4 統計分析

每個試驗獨立重復3次，結果以平行測定所得的平均值和標準差表示。用SPSS軟件進行單因素方差分析和Duncan多重檢驗進行分析，顯著性水平為

P

<0.05。

2 結果與分析

2.1 萌發率

超聲波及NaCl脅迫處理對苦蕎萌發率的影響如圖1所示。從圖1a可以看出，苦蕎麥種子經超聲波處理后，培養0～96 h，超聲功率240 W、280 W和320 W處理的種子萌發率高于對照組(P<0.05)。其中24～96 h，T處理組的萌發率顯著高于低功率T組(P<0.05)。96～168 h，不同功率處理間萌發率差異不顯著(P>0.05)。T處理的種子培養168 h (7 d)時，其萌發率為75.33%，分別比T、T和對照組高4%、0.67%和2%,說明超聲波處理在培養初期對苦蕎麥種子的萌發有一定的促進作用，其作用隨超聲波功率的增加而增強。Yaldagard曾報道超聲波(92～414 W，5～15 min)處理可使大麥種子萌發期縮短30%～45%，本研究結果與其一致。從圖1b可以看出，2.5～5.0 mol/L的NaCl溶液處理苦蕎種子后，在培養0～96 h內對萌發有一定的促進作用。超過120 h時，NaCl溶液處理組的萌發率均與對照組差異不顯著(P>0.05)。其中T處理后，168 h時，其萌發率為75.33%，分別比2.5 mmol/L和7.5 mmol/L處理組高1.33%和3.33%,說明低濃度NaCl溶液短時處理對苦蕎麥種子的萌發表現為促進作用，而高濃度則呈抑制作用，其中5 mmol/L時效果最佳。

苦蕎麥種子經超聲波處理后，再以2.5～7.5 mol/L的NaCl溶液處理(見圖1c和圖1d)，培養0～7 d(除48 h時外)其萌發率均與對照組差異不顯著(P>0.05)，說明超聲波處理未改善苦蕎種子對NaCl脅迫的適應能力以增加其發芽率。其中T處理，培養168 h (7 d)時，萌發率僅為78%,說明協同方式對種子在高濃度NaCl脅迫的適應能力的改善有限。

圖1 超聲波及NaCl脅迫處理對苦蕎萌發率的影響注：對照組(即未經超聲波、NaCl脅迫處理)。U240 W/30 min+W(T1)、U280 W/30 min+W(T2)、U320 W/30 min+W (T3)：分別為經超聲波240 W、280 W、320 W處理30 min，用蒸餾水培養的組別；NaCl 2.5 (T4)、NaCl 5.0 (T5)、NaCl 7.5 (T6)：分別為未經超聲波處理用濃度為2.5 mmol/L、5 mmol/L、7.5 mmol/L的NaCl溶液培養的組別；U320 W/30 min+ NaCl 2.5 (T7)、U320 W/30 min+ NaCl 5.0 (T8)、U320 W/30 min+ NaCl 7.5 (T9)：分別為經超聲波320 W處理30 min，用濃度為2.5 mmol/L、5 mmol/L、7.5 mmol/L的NaCl溶液培養的組別；U320 W/20 min+ NaCl5.0 (T10)、U320 W/10 min+ NaCl 5.0 (T11)：分別為經超聲波320 W分別處理20 min、10 min，用濃度為5 mmol/L的NaCl溶液培養的組別；下圖同。

2.2 種子萌發勢

超聲波協同NaCl脅迫對苦蕎種子芽長(7 d)的影響如圖2所示。從圖2a可看出，采用240 W、280 W和320 W功率的超聲波處理苦蕎麥種子，其芽長隨功率的增強而增加，T組最高，比對照組增加14.72%。2.5～7.5 mmol/L NaCl溶液處理苦蕎種子，其芽長隨NaCl溶液濃度的增加先減少后增加，但NaCl處理組均低于對照組，表現為抑制作用。超聲波協同NaCl溶液處理下芽苗的長度均低于對照組。從圖2b可看出，以功率為240～320 W的超聲波處理苦蕎麥，其芽苗根長度隨功率的增加而增加，但均高于對照組(P>0.05)。NaCl溶液濃度由2.5 mmol/L增加到7.5 mmol/L，根長逐漸縮短，僅2.5 mmol/L NaCl溶液處理組比對照組高12.10%?？嗍w麥種子經超聲波處理后再協同NaCl溶液處理時，其根長均未高于對照組(P>0.05)。Mirshekari和Goussous證實40～60 KHz超聲波預處理可以顯著提高小麥種子幼苗根、莖長的生長，本研究的結果與其一致。

圖2 超聲波協同NaCl脅迫對苦蕎種子芽長(7 d)的影響

2.3 POD和SOD活性

超聲波協同NaCl脅迫對苦蕎芽苗POD和SOD活性的影響如圖3所示。從圖3a可看出，苦蕎麥芽苗的POD活性隨超聲波功率的增加先升高后降低，其中T處理最高，達23.44±0.51 U·g·min，比對照組高19.21%，說明適度的超聲波處理有助于提高芽苗的POD活性；2.5～7.5 mmol/L NaCl溶液處理下，其芽苗的POD活性隨NaCl濃度的增大而先升高后降低且均高于對照組(P<0.05)。T組處理下酶活力最高，達48.67±1.53 U·g·min，比對照組高1.47倍，說明NaCl處理可以提高芽苗的POD活性(P<0.05)。經超聲波協同NaCl處理下芽苗中POD的活性隨NaCl濃度的增加而升高，其中T組處理后芽苗POD活性最高，達47.56±2.14 U·g·min。相同NaCl濃度下，超聲波協同NaCl處理組的芽苗中POD活性要高于對照組，而在NaCl濃度及超聲功率相同的情況下，其芽苗的POD活性隨超聲波處理時間的增加而先升高后降低。其中，T組處理下的芽苗的POD活性最高，達61.78±1.68 U·g·min，說明超聲波處理有助于提高苦蕎麥芽苗的POD活性。

從圖3b可看出，功率由240 W增至320 W，苦蕎麥芽苗中SOD活性隨超聲波功率的增大而增加，T處理最高，達61.90 U/mg，比對照組增加0.34 倍，說明適度的超聲波處理對芽苗的SOD活性有明顯的提高作用；而2.5～7.5 mmol NaCl溶液處理下，SOD活性隨著NaCl溶液的濃度增加而降低且均低于對照組(P<0.05)，說明NaCl脅迫對SOD活性有較強的抑制作用；苦蕎麥經超聲波協同NaCl處理下，SOD的活性隨NaCl濃度的增加先升高后降低但均低于超聲波處理組和對照組(P<0.05)。而在NaCl濃度及超聲功率相同下，芽苗SOD活性隨超聲波處理時間的增加而增加，說明超聲波處理有助于提高苦蕎麥芽苗的SOD含量以緩解NaCl脅迫對芽苗的影響。超聲波振動可以使細胞壁結構發生變化使酶從細胞壁內釋放，達到促進生化代謝的目的。有研究證實超聲波預處理有助于植物通過提高抗氧化酶活性來消除活性氧危害。

圖3 超聲波協同NaCl脅迫對苦蕎芽苗POD和SOD活性的影響

2.4 MDA和還原糖含量

超聲波協同NaCl脅迫對苦蕎芽苗MDA和還原糖含量的影響如圖4所示。從圖4a可看出，超聲波處理的苦蕎麥芽苗的MDA含量均低于對照組；而NaCl溶液處理下的苦蕎麥芽苗的MDA含量隨NaCl濃度增加先升高后降低，T組處理的MDA含量最高，達到8.48±0.11 nmol/g，比對照組增加29.88%(P<0.05)，除此組外，其他NaCl處理組的MDA含量均低于對照組；超聲波協同NaCl溶液處理時，在相同功率下(320 W)，MDA含量均低于對照組，且隨超聲處理時間延長而降低，T組處理MDA含量最低(5.62±0.02 nmol/g)，比對照組低13.93%(P<0.05)，說明超聲波可減少MDA的生成且其降低量與超聲波處理時間呈負相關。從圖4b可看出，以240～320 W功率的超聲波處理苦蕎種子，芽苗中還原糖含量隨功率增加而升高，T處理組最大，達11.25±0.09 mg/g，比對照組增加20.02%；2.5～7.5 mmol/L NaCl溶液處理苦蕎麥后，其芽苗還原糖含量隨NaCl溶液濃度的增加而降低，T處理組最高，為12.85±0.28 mg/g，比對照組高37.09%，但各組均高于對照組(P<0.05)，說明NaCl脅迫對還原糖的增加有促進作用且隨著NaCl濃度增加而逐漸減弱。超聲波協同NaCl脅迫處理下，苦蕎芽苗中還原糖的含量隨著NaCl濃度增加而逐漸變弱，其中僅T組高于對照組。當NaCl濃度為5 mmol/L，超聲波功率320 W時，隨超聲波處理時間的延長，芽苗中還原糖含量升高，但均低于對照組(P<0.05)，說明低濃度的NaCl脅迫，高功率長時間的超聲波處理有助于還原糖含量的增加。

圖4 超聲波協同NaCl脅迫對苦蕎芽苗MDA和還原糖含量的影響

2.5 總酚和總黃酮含量

超聲波協同NaCl脅迫對苦蕎芽苗中總酚和總黃酮含量的影響如圖5所示。從圖5a可看出，苦蕎芽苗中總酚含量隨超聲波功率增加而升高，T處理最高，達2.75±0.03 mg/g，比對照組增加6.85%；而2.5～7.5 mmol/L NaCl溶液處理的苦蕎麥，其芽苗中總酚含量隨NaCl濃度的增大而升高，但均低于對照組。超聲波協同NaCl處理，其芽苗中總酚的含量均高于對照組，其中T處理的芽苗總酚含量最高，其含量為2.89±0.01 mg/g，比對照組增加9.63%。在相對NaCl濃度下，超聲波協同NaCl脅迫處理的芽苗中總酚的含量要高于NaCl處理組(T)，說明超聲波處理有助于提高芽苗中總酚含量而鹽脅迫處理則呈抑制作用，且超聲波處理有助于緩解NaCl脅迫處理對苦蕎麥芽苗中總酚積累的負效應。但增加超聲波處理時間其總酚含量呈降低趨勢。

從圖5b可看出，苦蕎麥芽苗中總黃酮含量隨超聲波功率增加先升高后降低，T處理最高，為1.12±0.02 g/100 g，比對照組增加0.32倍，有報道證實超聲波處理能夠促進小麥幼苗的苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase, PAL)活性提高而增加黃酮類物質的含量。2.5～7.5 mmol/L NaCl溶液處理后，苦蕎芽苗中總黃酮含量隨其濃度的增加而逐漸增加，T組最高，達1.09±0.02 g/100 g，比對照組增加0.29倍；超聲波協同NaCl脅迫處理，苦蕎芽苗中總黃酮含量顯著高于對照組且隨NaCl濃度增加而增加，T組最大，達1.37±0.02 g/100 g，比對照組增加0.61倍。當超聲波功率為320 W，NaCl濃度為5 mmol/L時，隨著超聲處理時間的延長，總黃酮含量先升高后降低，T組最高，達1.71±0.03 g/100 g，比T組(5.0 mmol/L NaCl)和對照組分別增加0.21倍和1.01倍，說明超聲波、NaCl脅迫及超聲波協同NaCl脅迫均可促進苦蕎中總黃酮含量的增加。

圖5 超聲波協同NaCl脅迫對苦蕎芽苗中總酚和總黃酮含量的影響

2.6 DPPH自由基清除能力

超聲波協同NaCl脅迫對苦蕎芽苗DPPH清除能力的影響如圖6所示。從圖6可看出，芽苗對DPPH自由基的清除能力隨超聲波功率增加先增加后降低，T處理最高，達92.93±1.58%，高于對照組3.28%，說明適度的超聲波處理有助于提高芽苗對DPPH自由基的清除能力；NaCl溶液處理下，其芽苗對DPPH自由基的清除能力隨NaCl濃度的增大而降低，且均低于對照組，說明NaCl脅迫處理對芽苗對DPPH自由基的清除能力呈減弱作用；超聲波協同NaCl處理下的苦蕎麥，其芽苗對DPPH自由基的清除能力隨NaCl濃度的增加先升高后降低，其中T組處理的芽苗對DPPH自由基的清除能力最高，達91.92±0.44%。在相對NaCl濃度下，超聲波協同NaCl處理的芽苗對DPPH的清除能力要低于對照組但高于NaCl處理組(T)。而在相同的NaCl濃度及超聲功率下，增加超聲波處理時間，其芽苗對DPPH的自由基清除能力則先增加后降低，說明超聲波處理有助于緩解NaCl脅迫處理對苦蕎麥芽苗中DPPH的清除能力造成的負效應。超聲波處理能夠增強抗氧化酶活性從而提高種子的抗氧化能力從而抵抗不良環境。

圖6 超聲波協同NaCl脅迫對苦蕎芽苗DPPH清除能力的影響

3 結論

適宜功率的超聲波能在一定程度上促進苦蕎麥種子萌發和生長。低濃度的NaCl溶液處理對苦蕎麥種子初期的萌發、生長均有一定的促進作用，但高濃度對芽長和根長有抑制作用。超聲波處理對NaCl脅迫下的苦蕎萌發促進作用不顯著。超聲波處理可減少MDA的生成且其降低量與超聲波處理時間呈負相關，苦蕎芽苗中還原糖含量隨超聲波功率增加而升高，但隨NaCl溶液濃度的增加而降低，但均高于對照組。適宜功率的超聲波、低濃度NaCl溶液、超聲波協同NaCl脅迫均有助于提高芽苗的POD活性。NaCl溶液處理會降低芽苗的SOD活性和總酚含量，但超聲波處理有助于提高芽苗的SOD活性和總酚含量，并且緩解NaCl脅迫對SOD活性和總酚含量的積累造成的不利影響。低功率超聲波處理及超聲波協同NaCl脅迫處理均有助于增加總黃酮的含量和對DPPH自由基的清除能力。NaCl溶液處理顯著促進黃酮含量的增加但降低對DPPH自由基的清除能力。