膜分離工藝提高產品中高聚合度ε-聚賴氨酸含量

趙星宇，陳旭升，張宏建，張建華*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是由多個賴氨酸殘基通過α-COOH和ε-NH2連接而成的一種同型氨基酸聚合物[1]，聚合度多為5～35，分子質量一般在780～4 600 Da。ε-PL產品為淡黃色粉末，吸濕性強，極易溶于水，不溶于有機溶劑，熱穩定性較好，水溶液可以在100 ℃加熱 30 min 或者在120 ℃條件下加熱20 min不降解[2]。由于其主鏈上存在許多游離氨基，在酸性到弱堿性環境中表現出多陽離子特性。它對多種微生物，包括大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、酵母、霉菌和噬菌體均有抑制作用[3-6]。ε-PL 作為一種綠色、安全生物食品防腐劑被廣泛使用[7-8]。

研究表明，ε-PL的合成是在聚賴氨酸合成酶的催化作用下，以L-賴氨酸為前體，以非核糖體多肽合成方式聚合[9]。ε-PL的抑菌性能受其聚合度影響，日本學者SHIMA等[10]考察了ε-PL的抑菌性能，發現當ε-PL聚合度<9時，抑菌活性很低，ε-PL聚合度>25時，其抑菌性能最佳。在劉慶瑞等[11]的研究中，高聚合度ε-PL對革蘭氏陽性和陰性細菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)是發酵產生的ε-PL的1/2 ～1/4；聚合度<20的ε-PL的MIC 值是發酵產生的ε-PL 的2～4倍，ε-PL聚合度越高越有利于抑制細菌。KITO等[12]在Streptomycesalbulus細胞膜上發現了ε-PL降解酶(ε-poly-L-lysine-degrading enzyme，PLD)的存在，他們研究發現其最適pH值為7.0，在發酵過程中控制低pH可以避免ε-PL降解，從而積累高聚合度的ε-PL。NISHIKAWA等[13]在ε-PL合成過程中向培養基內同時添加甘油和璜化ε-環糊精，使得ε-PL分子質量由3.5～4.5 kDa減小到2.5 kDa，他們還提出了一種通過調節培養基中多元醇濃度來控制ε-PL中賴氨酸殘基數量的方法?，F有的對于ε-PL聚合度控制的研究大多集中在菌株改造和發酵過程控制等環節，通過下游分離工藝來控制商品ε-PL的聚合度卻尚未見報道。

膜分離技術是以選擇性透過膜為介質，借助于外界能量或化學位差的推動，實現多組分混合物進行分離、分級、提純以及濃縮富集的技術，其過程簡單，無相變，無二次污染且分離系數大[14-15]。本團隊前期篩選的鏈霉菌發酵生產的ε-PL聚合度主要分布在5～35，本研究旨在嘗試通過膜分離技術，在下游分離提取環節部分分離去除低聚合度(<25)ε-PL，提高產品中高聚合度(25～35)ε-PL含量，以提高單位產品的抑菌性能。

1 材料與方法

1.1 材料

ε-PL，江蘇一鳴生物科技有限公司；乙腈(純度≥99%)、甲基橙、NaClO4·H2O等常規試劑，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

實驗用膜片，泰州星達膜科技有限公司，主要參數如表1所示。

表1 膜片主要性能參數Table 1 Main parameters of membrane

1.2 儀器與設備

Synder小型超濾系統，泰州星達膜科技有限公司；PHS3TC pH計，上海天達儀器有限公司；UV2100分光光度計，優尼科儀器有限公司；AB204N分析天平，瑞士梅特勒公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，美國Agilent 公司。

1.3 ε-PL的分析

ε-PL濃度采用甲基橙比色法確定[16]。ε-PL聚合度通過離子對色譜[17-18]來測定。TSKgel ODS-80Ts色譜柱(4.6 mm×250 mm;Tosoh，Tokyo)，流動相A：10 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L NaClO4·H2O， 10 mmol/L辛烷磺酸鈉，磷酸調pH值至2.6。流動相B：20 mmol/L NaH2PO4，200 mmol/L NaClO4·H2O，20 mmol/L辛烷磺酸鈉，磷酸調pH值至2.6，50%(體積分數)乙腈。流動相梯度：50 ℃，85 min內，B從55%線性變化為90%，與A混合，0.4 mL/min。檢測波長：215 nm。該色譜條件下不同聚合度的ε-PL的校正因子相近，不同聚合度的ε-PL的含量由歸一化法來定量。

1.4 膜的截留率與透過率

膜的截留率如計算公式(1)所示：

(1)

式中：C0，原料液中的ε-PL質量濃度，g/L；C1，截留液中ε-PL質量濃度，g/L；V0、V1，料液、截留液的體積，L。

膜的透過率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：C2，透過液中ε-PL質量濃度，g/L；V2，透過液的體積，L。

1.5 膜通量的測定

通過測定一定時間得到的透過液體積，根據公式(3)計算膜通量：

(3)

式中：V，透過液的體積，L；A，膜面積，m2；t，過濾的時間，h。

1.6 透析過濾

本研究使用的小型膜分離裝置結構如圖1所示。操作方式參考李芳良等[19]的間歇變容滲濾。

1.7 ε-PL的抑菌性能

測定不同ε-PL產品的MIC，比較其抑菌性能[10]。細菌采用肉湯液體培養基，酵母菌采用YPD 液體培養基，霉菌采用PDA 液體培養基來培養。向每個試管內加入 1 mL稀釋后的ε-PL 溶液和1 mL培養基稀釋的菌液，使細菌菌液濃度約為 5×105CFU/mL，酵母菌、霉菌終濃度為0.5～2.5×103CFU/mL。其中，細菌第1～11管ε-PL質量濃度分別為 1，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 μg/mL，酵母菌和霉菌第1～11管ε-PL質量濃度分別為 1 200、1 100、1 000、900、800、700、600、500、400、200、100 μg/mL。細菌于37 ℃培養12 h，酵母菌、霉菌于37 ℃培養48 h后，肉眼觀察以完全抑制菌體生長的最低ε-PL濃度為最小抑菌濃度[11]。

2 結果與分析

2.1 膜片截留分子質量的選擇

ε-PL等電點約為9，在pH=9的溶液中，ε-PL接近電中性，選擇該pH條件對料液進行分離，可減少ε-PL帶電性在過膜過程中的干擾。選擇pH=9，質量濃度為10 g/L的ε-PL水溶液作為待分離料液，在壓力為0.25 MPa的條件下進行膜片的預篩。由圖2-a 可知，在同樣的操作條件下，膜的截留分子質量越大，其膜通量越大。膜MT(5 000 Da)對于ε-PL截留率較低，其他4種膜對ε-PL的截留率均達到80%以上。

通過對不同型號膜的透過液進行聚合度分析(圖2-b)，VT膜的綜合表現最好。VT膜透過液中低聚合度ε-PL含量最高，其低聚合度(<25)ε-PL含量為41.08%，聚合度在25～35的ε-PL含量為58.92%。VT膜標定的截留分子質量為3 000 Da，而聚合度為25的ε-PL的分子質量為3 348 Da，在后續的研究中，選擇VT膜進行研究。

2.2 操作壓力對高低聚合度ε-PL分離效果的影響

壓力會影響膜分離過程的體積通量，圖3-a可知體積通量隨著壓力的增加而增加。壓力基本上不會影響VT膜對高聚合度的ε-PL的透過率(圖3-b)，但是壓力較小時，低聚合度ε-PL透過率相對較高，可見在分離過程中，低聚合度的ε-PL相對更容易通過膜。但由于循環液中低聚合度ε-PL的含量很低(17.73%)，且高低聚合度的ε-PL分子質量差異并不顯著，因此分離效果并不明顯。由于壓力較低時膜通量很低，選擇0.25 MPa(約0.25 MPa)作為后續實驗的操作壓力。

2.3 pH對高低聚合度ε-PL分離效果的影響

VT對不同pH溶液中的ε-PL存在不同的篩分效果。VT對ε-PL溶液的截留率隨著pH的增加減少，如圖4-a所示，而體積通量基本上穩定。由圖4-b可知，隨著pH增加，透過液中的低聚合度ε-PL比例先增加后減少，在pH=6時，低聚合度ε-PL含量最高，為75.32%，在等電點附近，pH=9時，低聚合度ε-PL含量最低，為22.08%。

由圖4-c可知，ε-PL的透過率隨著pH的增加而增加。在pH=3時，VT對低聚合度ε-PL透過率為2.89%。當料液pH=10時，對低聚合度ε-PL透過率為37.51%，高聚合度ε-PL透過率為21.67%。而在pH=6時，透過液中低聚合度ε-PL比例較高，在該pH下，低聚合度ε-PL透過速率與高聚合度ε-PL相比差值更大，更有利于高低聚合度ε-PL的分離。

2.4 初始進料濃度對高低聚合度ε-PL分離效果的影響

VT膜對ε-PL的篩分效果受料液濃度影響。體積通量會隨著料液濃度的增加而降低，越稀的溶液在VT上的透過速率越快，膜對ε-PL的截留率也隨料液濃度的增加而減小(圖5-a)。進料液質量濃度為5 g/L的VT透過液中，低聚合度ε-PL的含量僅17.74%，VT膜基本上對溶液中高低聚合度的ε-PL沒有選擇性。而當進料液質量濃度為20 g/L時，低聚合度ε-PL的含量為48.04%，之后隨著濃度的增加，透過液中低聚合度的ε-PL比例反而減少。由圖5-b可知，低聚合度ε-PL的透過率隨著濃度的增加而增大，當初始進料質量濃度為30 g/L時，低聚合度ε-PL的透過率為25.25%。進料濃度會影響ε-PL的透過，隨著濃度增加，低聚合度ε-PL透過率得到提高，同時高聚合度ε-PL的透過率也會隨之增加，濃度增加到一定值時，膜對高低聚合度的ε-PL的選擇性降低。在本研究中，料液質量濃度為20 g/L，透過液中低聚合度ε-PL的比例最高，綜合分離效果更好，選擇20 g/L作為后續研究中的初始料液濃度。

2.5 透析前后產品聚合度變化

ε-PL溶液經VT透析后循環液和透過液色譜圖如圖6所示。循環液和透過液收集經濃縮控制質量濃度在10 g/L左右。經過不斷加水循環透析，循環液中聚合度<25的ε-PL幾乎被去除，經過歸一化處理，此時循環液中聚合度為25～35的ε-PL含量為91.22%。相對于原產品，25～35的ε-PL比例提高了8.38%。

2.6 不同聚合度分布的ε-PL產品的抑菌活力

通過VT透析后，我們比較了原產品與分離后產品的抑菌活力。由表2、表3可知，經過透析之后，循環液中25～35聚合度的ε-PL比例增加，無論是對于大腸桿菌還是金黃色葡萄球菌，其MIC值均低于原產品。而對于酵母和霉菌，透析后的產品與原來產品的抑菌活性無明顯差異?？梢?，高聚合度的ε-PL更有利于抑制細菌。

表2 VT透析前后聚合度比例Table 2 The ratio of polymerization degree before and after VT dialysis

表3 不同ε-聚賴氨酸產品的最小抑菌濃度Table 3 The MIC of different ε-PL products

2.7 高低聚合度 ε-PL透過VT膜的模型分析

為了研究ε-PL透過膜VT的方式，我們分析了ε-PL的二級結構，結果如表4所示。ε-PL主鏈是長的脂肪族烴鏈，幾乎不形成螺旋結構，主要為ε-折疊構象[20]。ε-PL側鏈氨基的電離常數為8.0～9.0，當pH值低于電離常數時，氨基帶有強正電荷，這導致主鏈中的殘基相互排斥，無法形成氫鍵并自由膨脹，在pH<8～9的循環液和透過液中，ε-PL主要為β-折疊和無規卷曲構型。

表4 不同pH水溶液中ε-PL二級結構Table 4 Structure of ε-PL in different pH aqueous solutions

由圖7可知，與循環液相比，透過液中不同聚合度的ε-PL均有透過，而低聚合度ε-PL透過較多。VT由PES制成的表面活性層與支撐層2層組成，該膜的分離作用主要取決于表面活性層，活性層內含有相互交聯的孔道。在pH<8～9的循環液和透過液中，不同分子質量的ε-PL呈折疊線型分子結構。當線型分子與膜面垂直時均能進入膜通道并透過，分子質量>3 000 Da的ε-PL仍然可能通過膜內的通道，分子質量<3 000 Da的ε-PL也可能會因為在膜的表面“架橋”而被截留下來，如圖8所示。分子質量越大，在膜表面“架橋”的幾率越大。在透析的過程中，分子質量<3 000 Da的ε-PL更容易透過膜，導致了高低聚合度ε-PL透過速度的差異，通過不停地向循環液加水循環，循環液中低聚合度ε-PL含量降低。但由于高低聚合度ε-PL分子質量差異不大，且均能透過膜片，單純靠分子質量的差異，并不能實現高低聚合度ε-PL的絕對分離。

3 結論

本研究嘗試在下游分離提取環節提高產品中高聚合度(25～35)ε-PL含量，篩選了截留分子質量為3 000 Da的PES膜VT，確定了該膜片用來高低聚合度ε-PL的操作壓力、料液pH和初始料液濃度。在操作壓力0.25 MPa下，對pH=6，初始質量濃度為20 g/L的料液進行了透析，透析之后的產品中聚合度在25～35的ε-PL含量達91.22%，較原產品提高了8.38%；比較透析前后產品的抑菌性能，透析之后產品更有利于細菌的抑制。最后，對于膜工藝分離ε-PL的分離過程進行了分析。膜分離工藝不能實現不同聚合度ε-PL的絕對分離，但可以提高產品中高聚合度ε-PL的比例，提高產品對細菌的抑菌性能，對于提高ε-PL應用價值具有重要意義。