北部灣養殖牡蠣體內異養細菌數量及其耐藥性研究

李炳, 王瑞旋, 張立, 羅幫, 牟紅莉, 王江勇

1. 上海海洋大學, 水產科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306;

2. 韓山師范學院, 廣東 潮州 521041;

3. 中國水產科學研究院南海水產研究所, 廣東省漁業生態環境重點實驗室, 廣東 廣州 510300;

4. 廣西壯族自治區水產科學研究院, 廣西 南寧 530021;

5. 惠州學院, 廣東 惠州 516007

香港牡蠣隸屬雙殼綱、牡蠣科, 其產量高、生長快、營養豐富、經濟價值高, 是我國華南沿海重要經濟貝類之一。近年來, 海域污染、養殖密度增加、純系種質退化、病害侵襲、缺乏科學管理等問題日漸凸顯(張銳, 2014)。在華南沿海牡蠣養殖區,大規模死亡事件時有發生, 一般在每年的3—5月份和10—12月份, 死亡率達80%～90%, 目前認為牡蠣的大規模死亡是由病害和環境等因素共同導致的(張占會, 2006)。在廣西的牡蠣養殖區(包括大風江、欽州港、青菜頭一帶), 每年4—5月期間牡蠣死亡率高達60%。據報道, 該區域春季降雨少, 鹽度居高不下, 香港牡蠣精卵的排放受到抑制, 進而性腺發育過熟和退化, 這可能是造成牡蠣大規模死亡的主要原因(於鋒 等, 2016)。夏季持續高溫導致牡蠣死亡的情況也有發生, 牡蠣在異常環境如病原體、溫度、鹽度和氨氮濃度等因素突變下, 會出現新陳代謝紊亂、免疫機能異常, 甚至發病死亡(廉偉 等, 2010)。牡蠣是濾食性的雙殼貝類, 主要通過過濾海水來獲取水體中的有機物、微生物作為食物。牡蠣在濾食過程中體內會大量聚集養殖水體中的細菌, 其中包括氣單胞菌(Aeromonas)、弧菌(Vibrio)等條件致病菌(Balbi et al, 2019; Grilo et al, 2020)?；【鷱V泛存在于海洋環境中, 弧菌中的某些致病菌, 如哈維弧菌(V.harvei)是一種毒力強、流行廣的細菌性病原體。據報道, 隨海水溫度、鹽度升高, 弧菌等條件致病菌繁殖達到一定閾值后, 致病菌將會侵襲貝類的外套膜、鰓、肝胰腺等組織, 造成貝類大量死亡(明紅霞等, 2015; 劉曉靖 等, 2019; Wickramanayake et al,2020)。

從上世紀40年代以來, 多種抗生素被應用在水生動物的細菌性疾病防治上, 例如土霉素、青霉素、卡那霉素、氯霉素等(Tendencia et al, 2001)。目前, 水產細菌性疾病的防治手段主要以抗生素為主, 因而抗生素的濫用情況時有發生, 導致細菌耐藥性問題日益嚴重(Wu et al, 2019; 魏文娟 等, 2020)。對皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)消化道中異養細菌耐藥率的研究發現, 大部分菌株為多重耐藥菌株, 對青霉素、卡那霉素、慶大霉素、利福平的耐藥率最高達83.9%(孫永嬋 等, 2017)。根據筆者此前對廣東沿海的香港牡蠣體內異養菌的研究, 異養細菌對青霉素、呋喃唑酮、克林霉素、卡拉霉素、阿莫西林及萬古霉素有較強的耐藥性, 且高溫時期分離的異養細菌大部分為多重耐藥細菌, 其在6月和9月所占比例分別為84.18%和91.72%(李炳 等, 2020)。眾所周知, 異養細菌在海洋生態系統中(如能量流動、物質循環等方面)起著重要作用。異養細菌作為水體有機質高低的指示生物, 在《水環境監測規范》(SL219-98)中, 異養細菌豐度是地表水和地下水水體監測的必測項目(肖慧, 2005; 謝煜 等, 2017;Begum et al, 2019)。本研究針對同一海域出現不同程度死亡的牡蠣, 從微生物角度出發探究牡蠣死亡率與微生物之間的相關性, 旨在了解牡蠣體內異養細菌數量與牡蠣死亡率之間的聯系以及牡蠣體內異養細菌種屬之間的差異。同時, 對牡蠣體內異養細菌的耐藥性進行比較分析, 掌握牡蠣體內異養菌的多重耐藥情況。本文研究結果能夠為牡蠣的細菌性疾病預警以及牡蠣的健康養殖提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

2019年5月在廣西北部灣茅尾海養殖區(鹽度:21‰～25‰; pH: 7.5～8.0; 溫度: 27.5℃)采集吊養的香港牡蠣樣本。采樣時, 在同一海域A、B、C三個采樣點隨機抽取數十吊, 并統計每吊死亡牡蠣的數量。其中, A采樣點的平均死亡率為70%(記為高死亡率養殖區), B采樣點的平均死亡率為50%(記為中死亡率養殖區), C采樣點的平均死亡率為20%(記為低死亡率養殖區)。隨機挑取有活性的牡蠣5～10個,清洗牡蠣外殼后稱取0.5g的內臟團并置于滅菌后的1.5mL玻璃勻漿器中, 加入無菌生理鹽水稀釋至10-3、10-4、10-5的稀釋度。將各個梯度的稀釋液涂布于腦心浸液瓊脂培養基(BHA培養基)、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基(TCBS培養基)、水解酪蛋白瓊脂培養基(MHA培養基), 這3種培養基均購于環凱生物科技有限公司。每個稀釋梯度設置3組平行, 培養基放于恒溫培養箱中28℃培養96h,培養后對各個培養基的異養細菌數量和弧菌數量進行統計。BHA培養基計數結果為異養細菌總數,TCBS培養基計數結果為弧菌數量, MHA培養基計數結果為對單種藥物具有抗性的菌株數量。

1.2 耐藥菌株(單種藥物)的分離

取牡蠣內臟勻漿液均勻涂布在添加了抗生素藥物的MHA培養基上, 分別為恩諾沙星(8μg·mL-1)、慶大霉素(16μg·mL-1)、環丙沙星(4μg·mL-1)、呋喃唑酮(4μg·mL-1)、氯霉素(8μg·mL-1)、利福平(4μg·mL-1)、復方新諾明(胺甲惡唑16μg·mL-1, 甲氧芐啶4μg·mL-1),抗生素藥粉購于上海阿拉丁生化有限公司。然后挑取培養基上的單菌落, 經過劃線分離和純化后保存, 將用于后續的菌株鑒定和細菌耐藥性研究中。

1.3 細菌16S rDNA的擴增及菌株鑒定

使用試劑盒提取細菌DNA(購于廣州吉瑞生物有限公司), 以細菌DNA為模板、上下游引物、PCR-mix、ddH2O進行PCR擴增。

反應體系(25μL體系): PCR-mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA模板1μL、ddH2O 9.5μL。采用引物8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492F(5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3')進行擴增。

擴增反應條件為: 95℃預變性5min, 95℃變性40s, 55℃復性40s, 72℃延伸45s, 其中第2步至第4步進行35個循環, 之后72℃延伸10min, 4℃終止反應。

PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳, 得到單一目的條帶之后(約1500bp), 樣品送至廣州天一輝遠有限公司進行序列測定, 將測序結果輸入GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中進行數據比對, 確定菌株的種屬。

1.4 藥物敏感實驗及耐藥率計算

本研究中藥敏紙片購于杭州生物試劑有限公司,分別為: 青霉素(10μg·mL-1)、阿莫西林(10μg·mL-1)、萬古霉素(30μg·mL-1)、恩諾沙星(10μg·mL-1)、諾氟沙星(10μg·mL-1)、氧氟沙星(5μg·mL-1)、環丙沙星(5μg·mL-1)、慶 大 霉 素(10μg·mL-1)、新 霉 素(30μg·mL-1)、鏈 霉 素(10μg·mL-1)、妥 布 霉 素(10μg·mL-1)、紅 霉 素(15μg·mL-1)、多 西 環 素(30μg·mL-1)、四 環 素(30μg·mL-1)、氟 苯 尼 考(30μg·mL-1)、氯霉素(30μg·mL-1)。

藥敏測試實驗采用紙片擴散法, 實驗操作過程參考相關藥敏實驗及研究文獻(李璐璐 等, 2014;Wang et al, 2014)。以大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)ATCC25923為參考菌株進行質控, 通過游標卡尺測量藥敏紙片的抑菌圈直徑。以CLSI文件M100藥敏實驗判定標準(Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012)判定菌株對抗生素的敏感程度, 并以S(敏感)、I(中度)、R(耐藥)表示。對各個菌株的抗性藥物進行分類、記錄, 形成其特有的耐藥譜型(耐藥譜型即菌株對不同抗生素的耐受情況),以便開展后續的耐藥性分析(毛燦 等, 2020)。對3種及3種以上的抗生素存在抗性的菌株被判定為多重耐藥菌(Magiorakos et al, 2012)。計算不同死亡率養殖區菌株的多重耐藥指數為 Σn/(D×S)(Krumperman, 1983), 其中n為菌株存在抗性的藥物數量, Σn即為所有菌株存在抗性的藥物數量總和;D和S分別是實驗所用的抗生素種類數量和菌株數量。耐藥譜型豐富度(%)=耐藥譜型種數/耐藥譜型總數×100。

1.6 數據分析

使用Excel 2010軟件、IBM SPSS 22進行實驗數據及單因素方差分析, 利用Spearman進行相關性分析, 進一步統計分析異養細菌數量、弧菌數量和牡蠣死亡的相關性。

2 結果

2.1 牡蠣體內細菌與牡蠣死亡率的相關性分析及細菌數量統計

各養殖區的牡蠣體內異養細菌和弧菌經分離、培養和統計, 異養細菌數量由高到低依次為: 高死亡率養殖區[(8.6±0.4)×106CFU·g-1]＞中度死亡率養殖區[(6.9±0.2)×106CFU·g-1]＞低死亡率養殖區[(3.3±0.1)×106CFU·g-1]; 弧菌數量由高到低依次為:高死亡率養殖區[(9.5±0.4)×105CFU·g-1]＞中死亡率養殖區[(4.5±0.6)×105CFU·g-1]＞低死亡率養殖區[(2.5±0.6)×105CFU·g-1]。對各個養殖區牡蠣體內異養細菌和弧菌數量的平均值分別取對數值, 結果顯示異養細菌數量比弧菌數量高1～2個數量級(圖1)。高死亡率養殖區牡蠣體內異養細菌數量與低死亡率養殖區牡蠣體內異養細菌數量差異極顯著(P＜0.01);高死亡率養殖區牡蠣體內弧菌數量與低死亡率養殖區牡蠣體內弧菌數量差異顯著(P＜0.05)。根據各養殖區牡蠣體內異養細菌及弧菌數量經SPSS進行的Spearman相關性分析結果(見表1), 異養細菌數量與牡蠣死亡率的相關系數為0.996, 弧菌數量與牡蠣死亡率的相關系數為0.936。

圖1 各養殖區域牡蠣體內的異養細菌數量和弧菌數量Fig.1 The numbers of heterotrophic bacteria and Vibrio in oysters from different farming areas

表1 牡蠣死亡率與細菌數量的相關性Tab.1 Correlation between oyster mortality and number of bacteria

根據不同抗生素培養基生長細菌數量的對數值(圖2)可知, 來自不同死亡率養殖區域的牡蠣細菌數量差異較大, 并且以利福平和呋喃唑酮培養基生長的細菌數量較大。其中, 高死亡率環境中的牡蠣體內的細菌主要在慶大霉素、利福平、氯霉素、呋喃唑酮、環丙沙星培養基上生長, 數量分別為9.4×102CFU·g-1、7.8×103CFU·g-1、2.0×102CFU·g-1、1.1×104CFU·g-1、2.0×102CFU·g-1; 中度死亡率環境中的牡蠣體內的細菌主要在慶大霉素、利福平、氯霉素、呋喃唑酮培養基上生長, 數量分別為4.0×102CFU·g-1、1.1×104CFU·g-1、8.0×102CFU·g-1、1.4×104CFU·g-1; 低死亡率環境中的牡蠣體內的細菌僅在慶大霉素、利福平、呋喃唑酮培養基上生長,數 量 分 別 為 6.0×102CFU·g-1、9.0×103CFU·g-1、1.1×104CFU·g-1。

圖2 不同抗生素培養基生長的細菌數量Fig.2 The numbers of heterotrophic bacteria and Vibrioin oysters from different farming areas

2.2 牡蠣體內耐藥細菌的鑒定及分類

牡蠣體內的耐藥細菌經添加單種抗生素的藥物平板篩選后, 進一步進行分離、培養、鑒定。如表2所示, 在高死亡率環境中的牡蠣體內分離了64個菌株, 主要來自呋喃唑酮、利福平、慶大霉素、環丙沙星和氯霉素的培養基; 在中死亡率環境中的牡蠣體內分離了68個菌株, 主要來自呋喃唑酮、利福平、氯霉素、慶大霉素的培養基; 低死亡率環境中的牡蠣體內分離了24個菌株, 主要來自呋喃唑酮、利福平和慶大霉素的培養基。

表2 各養殖區牡蠣體內的耐藥菌株種屬及數量Tab. 2 Classification of antibiotic-resistant strains in oysters from different farming areas

根據表2所示, 高死亡率養殖區域牡蠣體內分離的耐藥菌株主要為: 弧菌屬(Vibrio)、發光桿菌屬(Photobacterium)、大洋單胞菌屬(Oceanimonas)、類香味菌屬(Myroides)、海單胞菌屬(Marinomonas)、藤桿菌屬(Tenacibaculum)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、短波單胞菌屬(Brevundimonas); 中死亡率養殖區域牡蠣體內分離的耐藥菌株主要為: 弧菌屬(Vibrio)、發光桿菌屬(Photobacterium)、海單胞菌屬(Marinomonas)、大洋單胞菌屬(Oceanimonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、芽孢桿菌屬(Bacillus); 低死亡率區域牡蠣體內分離的耐藥菌株主要為: 弧菌屬(Vibrio)、發光桿菌屬(Photobacterium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、希瓦氏菌屬(Shewanella)。

2.3 牡蠣體內細菌對不同抗生素的耐藥情況

對牡蠣體內分離的耐藥菌進行了16種常用藥物敏感性實驗, 耐藥菌對各藥物的耐藥率如圖3所示。由圖3可知, 異養細菌對β-內酰胺類(青霉素、阿莫西林)、糖肽類(萬古霉素)抗生素表現出較高的耐藥率, 平均為69.2%; 對四環素類(四環素、多西環素)的耐藥率平均為31.6%; 對氨基糖苷類(慶大霉素、鏈霉素、新霉素、妥布霉素)的耐藥率平均為20.2%; 對大環內酯類(紅霉素)、氯霉素類的耐藥率平均為14.5%; 對喹諾酮類(諾氟沙星、環丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星)的耐藥率平均為5.1%。

圖3 異養細菌對不同抗生素的耐藥率Fig.3 Resistant rate of bacteria to different antibiotics

低死亡率養殖區牡蠣體內分離的24個菌株對各種抗生素的耐藥性存在差異(表3), 其中對青霉素、萬古霉素、阿莫西林的耐藥率較高, 分別為75%、50%和45.8%, 對妥布霉素、四環素、鏈霉素、多西環素的耐藥率介于33.3%～20.8%, 對紅霉素、氯霉素、新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星的耐藥率在10%以下。根據表3所示, 低死亡率養殖區牡蠣體內分離的菌株的耐藥譜型共17種, 分別為H1～H17, 譜型豐富度為70.8%。H1～H3型對1種抗生素耐藥, 占總菌數的16.6%; H4、H5型對2種抗生素耐藥, 占總菌數的25.0%; H6、H7型對3種抗生素耐藥, 占總菌數的12.5%; H8、H9型對4種抗生素耐藥, 占總菌數的16.6%; H10～H12型對5種抗生素耐藥, 占總菌數的12.5%; H13～H15型對6種抗生素耐藥, 占總菌數的12.5%; H16型對7種抗生素耐藥, 占總菌數的4.16%; H17型對14種抗生素耐藥, 占總菌數的4.16%。在低死亡率養殖區牡蠣分離的菌株中, 多重耐藥菌株占58.4 %, 多重耐藥指數(MARI)為0.28。

表3 低死亡率養殖區牡蠣體內異養細菌的耐藥譜Tab. 3 Antibiotic resistance spectrum of heterotrophic bacteria in oysters in low-mortality farming area

中死亡率養殖區的牡蠣體內分離的68個菌株對16種抗生素的耐藥存在差異, 其中對青霉素、萬古霉素的耐藥率為92.6%, 對阿莫西林、四環素、多西環素的耐藥率分別為42.6%、32.3%、27.9%, 對鏈霉素、慶大霉素、紅霉素、新霉素、氯霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星的耐藥率均在15%以下。中死亡率養殖區牡蠣分離的菌株的耐藥譜型共30種(表 4), 分別為M1～M30, 譜型豐富度為44.2%。M1～M3型對1種抗生素耐藥, 占總菌數的4.42%; M4、M5型對2種抗生素耐藥, 占總菌數的29.4%; M6～M12型對3種抗生素耐藥, 占總菌數的27.9%; M13～M19型對4種抗生素耐藥, 占總菌數的16.1%; M20～M23型對5種抗生素耐藥, 占總菌數的7.35%; M24～M27型對6種抗生素耐藥, 占總菌數的8.82%; M28、M29型對7種抗生素耐藥, 占總菌數的2.9%; M30型對8種抗生素耐藥, 占總菌數的1.47%。在中死亡率養殖區牡蠣體內分離的菌株中, 多重耐藥菌株占66.2%,多重耐藥指數(MARI)為0.22。

表4 中死亡率養殖區牡蠣體內異養細菌的耐藥譜Tab. 4 Antibiotic resistance spectrum of heterotrophic bacteria in oysters in medium-mortality farming area

續表

高死亡率養殖區的牡蠣體內分離的64個菌株對16種抗生素的耐藥存在差異, 其中對青霉素、萬古霉素的耐藥率分別為81.3%、73.4%, 對鏈霉素、阿莫西林和四環素的耐藥率分別為45.3%、42.3%、43.3%, 對紅霉素、妥布霉素、諾氟沙星、慶大霉素、氯霉素、新霉素和多西環素的耐藥率為29.7%～21.9%, 對恩諾沙星、氧氟沙星、環丙沙星的耐藥率在11%以下。高死亡率養殖區牡蠣分離的菌株的耐藥譜型共48種(表5), 分別為D1～D48, 譜型豐富度為75%。D1～D4型對1種抗生素耐藥, 占總菌數的10.9%; D5型對2種抗生素耐藥, 占總菌數的9.4%; D6～D15型對3種抗生素耐藥, 占總菌數的27.9%; D16～D20型對4種抗生素耐藥, 占總菌數的7.81%; D21～D26型對5種抗生素耐藥, 占總菌數的14.1%; D27～D35型對6種抗生素耐藥, 占總菌數的15.6%; D36～D40型對7種抗生素耐藥, 占總菌數的10.9%; D41型對8種抗生素耐藥, 占總菌數的3.1%;D42～D46型對9種抗生素耐藥, 占總菌數的7.8%;D47型對11種抗生素耐藥, 占總菌數的1.5%; D48型對12種抗生素耐藥, 占總菌數的3.1%。在高死亡率養殖區牡蠣體內分離的菌株中, 多重耐藥菌株占79.7%, 多重耐藥指數(MARI)為0.31。

表5 高死亡率養殖區牡蠣體內異養細菌的耐藥譜Tab. 5 Antibiotic resistance spectrum of heterotrophic bacteria in oysters in high-mortality farming area

續表

3 討論

3.1 不同死亡率養殖區的牡蠣體內異養細菌和弧菌數量分析

異養細菌在養殖生態系統中有著重要的作用,其生長速度快、周期短、變化快(Zaccone et al, 2002;Huang et al, 2020)。據報道, 異養細菌能夠指示水體中有機質的高低, 在《水環境監測規范》(SL219-98)中是水體監測的必檢項目(謝煜 等, 2017)。異養細菌的數量及組成的變化可間接地影響養殖動物的健康(González et al, 2003; 駱向萍 等, 2014)。異養細菌中的弧菌廣泛存在于海洋環境和海洋動物體內,大多數病原弧菌具有侵襲貝類的外套膜、鰓、肝胰腺等組織的能力, 從而引起貝類大規模死亡(張穎雪等, 2019; Xie et al, 2020)。本研究中異養細菌數量由高到低依次為: 高死亡率養殖區(8.6×106CFU·g-1)＞中死亡率養殖區(6.9×106CFU·g-1)＞低死亡率養殖區(3.3×106CFU·g-1)。高死亡率和中死亡率養殖區牡蠣體內異養細菌多樣性較豐富, 其中弧菌、發光桿菌、大洋單胞菌、希瓦氏菌等出現頻率較高; 低死亡率養殖區牡蠣體內分離的異養細菌種類較單一, 主要為發光桿菌和弧菌。在易引發海參病害的池塘中,弧菌總數(3.4×105CFU·g-1)顯著高于正常池塘(2.5×105CFU·g-1)(陳文博 等, 2012)。本研究中高死亡率養殖區牡蠣體內的異養細菌數量為8.6×106CFU·g-1,弧菌數量為9.5×105CFU·g-1, 較Wang等(2016)對牡蠣體內異養細菌數量(5.3×104CFU·g-1)和弧菌數量(6.0×103CFU·g-1)的周年監測結果高出1～2個數量級。

環境因子與異養細菌的數量有著密切的關系。鐘碩良等(2012)對貝類養殖環境中異養細菌的研究發現, 異養細菌數量在不同環境中的大小排序為:蝦塘養殖區＞灘涂養殖區＞淺海養殖區。根據凌慧等(2019)對方斑東風螺養殖水體中的細菌數量研究結果發現, 異養細菌的數量與氮氨呈正相關關系, 與亞硝酸鹽氮則呈負相關關系, 弧菌數量與溫度呈負相關關系。因此, 在后續的研究中應更多地關注環境因子對牡蠣體內異養細菌數量的影響, 了解異養細菌與鹽度、溫度、氮氨等環境因子之間的關系。本研究中3個不同牡蠣死亡率的采樣點在同一海區,其鹽度、溫度等環境因素差異不大, 因而從微生物角度出發探究牡蠣不同死亡率之間的差異。有研究表明異養細菌和弧菌數量越高, 病害發生幾率越大(Cao et al, 2015; 董楊 等, 2016)。本研究中弧菌數量由高到低依次為: 高死亡率養殖區(9.5×105CFU·g-1)＞中死亡率養殖區(4.5×105CFU·g-1)＞低死亡率養殖區(2.5×105CFU·g-1), 牡蠣體內異養細菌數量和弧菌數量與死亡率呈正相關關系, 相關系數分別為0.99和0.93。這表明在水產養殖中弧菌數量與養殖牡蠣的健康密切相關, 弧菌在異養細菌中占絕大多數, 牡蠣體內弧菌數量越多, 異養細菌豐度越大, 牡蠣發病死亡的風險就越高。

3.2 不同死亡率養殖區的牡蠣體內異養細菌耐藥性分析

目前, 針對水產細菌性疾病的主要防治方式是使用抗生素。然而水生動物對抗生素藥物的代謝吸收僅有20%～30%(李兆新 等, 2017), 水生環境中殘留著大量的抗生素(Chen et al, 2019)。細菌在抗生素的選擇性壓力下發生自適應突變, 從而細菌耐藥性變強, 甚至出現多重耐藥的“超級細菌”(Huo et al,2010)。據報道, 水產養殖中細菌對酰胺醇類、四環素類的耐藥率較高, 而對喹諾酮類的耐藥率較低(王瑞旋 等, 2013; 吳小梅 等, 2015)。本研究中來自各養殖區的牡蠣所分離的異養細菌對β-內酰胺類抗生素(青霉素、阿莫西林)的耐藥率較高, 對大環內酯類(紅霉素)、喹諾酮類(諾氟沙星、環丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星)的耐藥率較低, 這與李炳等(2020)對廣東沿海牡蠣體內的細菌耐藥性研究結果相似。本研究揭示了細菌對青霉素、卡那霉素、克林霉素、呋喃唑酮、阿莫西林及萬古霉素表現出較強的耐藥性。本研究分離的耐藥細菌主要為弧菌屬、發光桿菌屬、假單胞菌屬、希瓦氏菌屬等革蘭氏陰性(G-)菌, 其細胞壁的肽聚糖含量低, 細胞壁不易受損;青霉素、萬古霉素、阿莫西林等抗生素主要針對革蘭氏陽性(G+)菌細胞壁的肽聚糖, 故耐藥率較高。本研究中, 高死亡率養殖區的牡蠣所分離的細菌主要來自呋喃唑酮、慶大霉素、利福平、氯霉素和環丙沙星培養基, 而低死亡率養殖區牡蠣體內的細菌僅在呋喃唑酮、慶大霉素和利福平培養基上生長, 在氯霉素、環丙沙星和復方新諾明培養基上卻幾乎沒有生長。這一結果間接反映了不同死亡率養殖區牡蠣體內的細菌耐藥性差異, 高死亡率養殖區的牡蠣體內耐藥細菌數量多、耐藥譜型較廣; 低死亡率養殖區的牡蠣體內耐藥細菌較少, 對環丙沙星、氯霉素和復方新諾明等藥物較敏感。

多重耐藥細菌廣泛存在于養殖水體中(Prabhu et al, 2007; Abriouel et al, 2008)。據寫臘月等(2011)對海水養殖弧菌耐藥性的調查結果, 多重耐藥細菌的比例高達80.4%; 王瑞旋等(2012)在對水產致病菌耐藥性的研究中發現, 多重耐藥菌株占68.5%。某些病原菌對抗生素具有廣譜性的耐藥, 其耐藥性可能通過耐藥基因等移動元件水平傳播到其他致病菌,從而進一步威脅水生動物甚至人類的健康(Li et al,2020 )。本研究中由單種藥物篩選分離得到的異養細菌大多數顯示出多重耐藥性, 其中高死亡率養殖區的牡蠣體內多重耐藥菌占79.7%, 其耐藥譜型(48種)較廣; 中死亡率養殖區牡蠣體內多重耐藥菌占66.2%, 其耐藥譜型為30種; 低死亡率養殖區牡蠣體內多重耐藥菌占58.4%, 其耐藥譜型為17種。Krumperman(1983)在多重耐藥指數研究中指出, 多重耐藥指數＞0.2說明細菌可能受到抗生素污染的風險較高。本研究中牡蠣體內異養細菌的多重耐藥指數(MARI)為0.22～0.31, 多重耐藥指數偏高, 異養細菌可能處于抗生素暴露狀態。因此, 在生產實踐中應盡可能地減少抗生素的使用, 避免抗生素濫用和污染等情況的出現。

4 結論

本文研究結果表明, 不同死亡率環境中牡蠣體內的異養細菌數量由高到低依次為: 高死亡率養殖區[(8.6±0.4)×106CFU·g-1]＞中 度 死 亡 率 養 殖 區[(6.9±0.2)×106CFU·g-1]＞低死亡率養殖區[(3.3±0.1)×106CFU·g-1]; 弧菌數量由高到低依次為: 高死亡率養 殖 區[(9.5±0.4)×105CFU·g-1]＞中 死 亡 率 養 殖 區[(4.5±0.6)×105CFU·g-1]＞低死亡率養殖區[(2.5±0.6)×105CFU·g-1]。牡蠣體內的弧菌數量與牡蠣死亡率呈正相關關系, 進一步反映了弧菌數量越多, 牡蠣死亡的風險越大。本研究分離獲得的耐藥細菌主要為弧菌屬、發光桿菌屬、假單胞菌屬、希瓦氏菌屬等革蘭氏陰性菌。分離的菌株對β-內酰胺類抗生素(青霉素)、糖肽類(萬古霉素) 的耐藥率較高; 對四環素類(四環素、多西環素)的耐藥率次之; 對氨基糖苷類(鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、新霉素)、大環內酯類(紅霉素、氯霉素)、喹諾酮類(諾氟沙星、環丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星)的耐藥率較低。不同死亡率養殖區牡蠣體內的多重耐藥細菌數量由高到低依次為: 高死亡率養殖區(79.7%)＞中死亡率養殖區(66.2%)＞低死亡率養殖區(58.4%), 多重耐藥指數(MARI)為0.22～0.31。牡蠣不同程度的死亡與其體內的異養細菌數量和細菌耐藥性有關, 異養細菌數量與牡蠣死亡率呈正相關關系, 相關系數為0.996。