葡萄柚籽提取物和聚乙烯包裝處理對香椿貯藏期微生物變化的影響

林少華，阿依圖拉·拜各吐木爾，陳存坤，張慧杰，羅紅霞*，李相陽*，許文濤

葡萄柚籽提取物和聚乙烯包裝處理對香椿貯藏期微生物變化的影響

林少華1，阿依圖拉·拜各吐木爾2，陳存坤3，張慧杰4，羅紅霞1*，李相陽2*，許文濤5

(1. 北京農業職業學院食品與生物工程系，北京 102442；2. 食品質量與安全北京實驗室，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206；3. 國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津），天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384；4. 天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全省部共建教育部重點實驗室，天津 300457；5. 中國農業大學食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100083)

基于香椿因采摘期短、季節性強和極易腐爛變質等問題，以二茬香椿為原料，采用不同濃度的葡萄柚籽提取物（GSE）和聚乙烯（PE）包裝對其進行保鮮處理，測定其貯藏期間的菌落總數、霉菌酵母菌數及細菌和真菌的生物多樣性。結果表明，0.5% GSE結合PE保鮮膜處理組能夠有效地抑制菌落總數以及霉菌酵母菌數的增長；優勢細菌門為藍菌門（）和變形菌門（），優勢細菌屬為產堿菌屬（）和紅色桿菌屬（）；優勢真菌門為子囊菌門（）和擔子菌門（），優勢真菌屬為短梗霉屬（）和斯賓塞馬丁氏孢菌屬（）。香農指數和主成分分析結果表明，0.5% GSE結合PE保鮮膜處理組的細菌和真菌生物多樣性最低，微生物群落更加穩定。

葡萄柚籽提取物；聚乙烯包裝；香椿；貯藏保鮮；微生物

近年來，由于抗菌活性和安全性，利用天然提取物對果蔬進行保鮮處理以控制其腐爛，延長其貯藏時間，越來越受到人們的重視[1-2]。這些天然提取物包括了中草藥植物浸提液、天然植物精油和動物源提取物等動植物原料，它們具有操作簡便、處理成本低及無污染等優點，從而得到了快速的發展[3]。作為木本蔬菜的香椿（），因采摘期短，水分含量高、營養豐富，極易腐爛變質[4]。研究者們也分別采用物理和化學等方法對其保鮮處理，但采用天然提取物等生物保鮮技術的研究較少。陳麗娟等[5]采用外源甜菜堿對香椿進行處理，香椿嫩芽在貯藏期間的質量損失和腐爛現象得到了控制。

葡萄柚籽提取物（Grapefruit seed extract，GSE）是一類來源于葡萄柚種子和果肉中的提取物，它含有豐富的多酚化合物、類黃酮（柚皮苷）、檸檬酸、抗壞血酸、生育酚、檸檬酸和其他微量化合物[6]，具有抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗寄生蟲等作用[7-9]，并被證明安全、無人體毒性[10]，廣泛應用于食品加工、制藥和化妝品行業[11-12]。研究表明，GSE能夠抑制鮮切綠色蔬菜上的細菌性病原體，并延長其保存時間[13]；它還通過延遲感官和視覺特性方面與變質相關的參數，有效地降低了“紅地球”葡萄貯藏期間的腐爛率，并延緩了其質量的下降[14]。此外，采用保鮮膜對蔬菜進行包裝處理是常用的延緩水分流失的主要方式[15]，PE膜韌性、防潮性和熱塑封性均良好，且價格便宜，常用于蔬菜的貯藏保鮮[4, 16-18]。本實驗室前期研究了GSE+PE處理香椿采后貯藏過程中品質變化的影響（相關研究成果另文發表），在此基礎上，本文重點研究了GSE+PE處理對香椿采后貯藏過程中微生物數量和生物多樣性變化的作用，以期為該保鮮處理的可行性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

二茬香椿，北京市門頭溝區雁翅鎮葦子水村現采摘；GSE，中國農業大學食品營養與人類健康高精尖創新中心；菌落總數測試片、霉菌酵母菌測試片，廣東達元綠洲食品安全科技股份有限公司；PE膜（厚度為0.02 mm，O2滲透率是7.15 Lm-2·d-1·atm-1，CO2滲透率是23.14 Lm-2·d-1·atm-1，水蒸氣透過率為5.15 g·m-2·d-1），國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津）；DNA提取試劑盒，北京福德安科技（北京）有限公司；10×PCR buffer、dNTP、DNA聚合酶和10×Loading buffer，寶生物工程（大連）有限公司；引物、DNA Marker（分子量范圍為100 ～ 1 500 bp），賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器設備

MDF-382E超低溫冰箱，日本三洋電機公司；5804 R離心機，艾本德中國有限公司；ALD1244 PCR擴增儀和CFX96定量PCR儀，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；E凝膠成像儀，美國UVP公司；Miseq高通量測序儀，美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理 現場戴一次性手套采摘成熟度和長度基本一致的二茬香椿，并置于PE保鮮袋中3 h內常溫運回實驗室進行保鮮處理，操作人員均戴一次性手套。試驗樣品隨機分為4 組，每組10份，每份重500 g，并進行以下處理：CK組（對照組），選用0.02 mm厚度的PE保鮮膜包裹；0.1% GSE組、0.3% GSE組和0.5% GSE組為：將香椿分別浸泡在質量濃度為0.1%、0.3%和0.5%的常溫GSE溶液中1 min。GSE溶于滅菌后的蒸餾水中，香椿從GSE溶液中撈出后置于經過75%酒精擦拭后的臺面上晾4 h，然后用0.02 mm厚度的PE保鮮膜包裹。所有處理組均貯藏于溫度為（1 ± 0.5）℃，濕度為（90 ± 5）%的冷庫中，分別于0、8、16、24 和32 d進行取樣，每次樣品置于–80 ℃超低溫冰箱中進行冷凍保存，備用于微生物多樣性的檢測，檢測重復3次。

1.3.2 菌落總數和霉菌酵母菌數測定 菌落總數和霉菌酵母菌數測定按照綠洲生化牌菌落總數測試片和霉菌酵母菌測試片的操作方法進行培養和計數。

1.3.3 微生物多樣性的測定 樣品的細菌和真菌的生物多樣性的測定參考Lin等[4]的方法。

1.4 數據處理

采用Excel 2017軟件對數據進行整理，運用SPSS 20.0（IBM，USA）軟件對不同組間的數據進行顯著性分析，并采用最小顯著差數法（LSD）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 菌落總數和霉菌酵母菌數的變化

不同處理組的香椿在貯藏期間的菌落總數和霉菌酵母菌數的變化情況結果（圖1和圖2）顯示，GSE隨著處理濃度的增加，對香椿貯藏期間菌落總數和霉菌酵母菌數量的抑制作用更強，這是因為隨著GSE濃度的增大，多酚類物質的含量也相應增大，抗菌活性也相應增大[19]。多酚類物質能使微生物細胞膜的通透性增大，膜流動性受到影響，從而阻礙微生物蛋白質的表達，進而起到抑菌作用[20-22]。張南等[19]研究發現，能使釀酒酵母細胞核濃縮并導致核裂及 DNA 斷鏈，并引起其細胞內活性氧大幅增加，誘導其凋亡。因此，GSE能有效地抑制細菌和真菌的繁殖。本文的研究結果與GSE在無淀粉火腿腸[23]、鴨梨果實[24]和香菇[25]等食品的貯藏保鮮結果一致。

*P < 0.05，**P < 0.01。下同。

Figure 1 Changes of total plate count ofin different treatment groups

2.2 香椿貯藏期間微生物多樣性的變化

2.2.1 細菌門和屬分類水平的變化 不同處理組的香椿在貯藏期間的細菌在門和屬分類水平上的相對豐度變化情況分別如圖3和圖4所示。因32 d的CK處理組已腐爛，所以未對該處理組進行微生物多樣性的測定。從圖3可以看出，在測序發現的6個細菌門中，第一豐度的是藍菌門（），該研究結果與紫外殺菌的保鮮處理方法的結果一致[26]，這表明藍菌門較具有更高的耐受性。其次是變形菌門（），這是一類包括大腸桿菌、沙門氏菌等致病菌的細菌門，其相對豐度在經GSE處理初期受到抑制。Palma等[27]研究發現，GSE對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等人類致病菌具有高度的抗菌活性。然而隨著貯藏時間的延長，變形菌門豐度的增加也意味著香椿表面致病菌的豐度也存在增加的可能性。從圖4可以看出，在前十大相對豐度高的屬中，產堿菌屬（）和紅色桿菌屬（）的相對豐度占絕對優勢，其中，產堿菌屬在經GSE處理的當天相對豐度最高，這表明GSE對該菌屬的抑制作用最??；然而，隨著香椿貯藏時間的延長，4個處理組的產堿菌屬的相對豐度總體呈現下降趨勢，可能是由于其他菌屬微生物的生長繁殖導致的。但紅色桿菌屬的相對豐度則隨著貯藏時間的延長而上升，紅色桿菌屬屬于放線菌門（），圖3中的結果表明放線菌門的相對豐度也呈上升趨勢。

圖2 不同處理組的香椿霉菌酵母菌數變化

Figure 2 Changes of molds and yeasts ofin different treatment groups

圖3 門水平下細菌生物多樣性的變化

Figure 3 Variation of bacterial biodiversity at phylum level

圖4 屬水平下細菌生物多樣性的變化

Figure 4 Variation of bacterial biodiversity at genus level

圖5 門水平下真菌生物多樣性的變化

Figure 5 Variation of fungal biodiversity at phylum level

圖6 屬水平下真菌生物多樣性的變化

Figure 6 Variation of fungal biodiversity at genus level

2.2.2 真菌門和屬分類水平的變化 不同處理組的香椿在貯藏期間的真菌在門和屬分類水平上的相對豐度變化情況分別如圖5和圖6所示。從圖5可以看出，香椿在貯藏期間有3個門，其中，優勢真菌門為子囊菌門（）和擔子菌門（）。子囊菌門的相對豐度隨著貯藏時間的延長而下降，但擔子菌門的相對豐度則上升，與紫外、1-MCP和乙烯吸附劑等保鮮處理的結果一致[26]。從圖6可以看出，在前十大相對豐度最高的屬中，短梗霉屬（）和斯賓塞馬丁氏孢菌屬（）的相對豐度占絕對優勢，其中，短梗霉屬的相對豐度隨著香椿貯藏時間的延長而下降，但斯賓塞馬丁氏孢菌屬的相對豐度則上升。

2.3 樣品香農指數和主成分分析

不同GSE濃度處理的香椿在貯藏期間的細菌和真菌香農指數（Shannon）如圖7所示。香椿經過0.5%GSE處理后，其細菌和真菌的生物多樣較CK組差異極顯著（< 0.01），較0.1%GSE組差異顯著（< 0.05），但細菌的生物多樣性與0.3%GSE組差異不顯著，而真菌則差異顯著（< 0.05）。研究結果表明，具有殺菌作用的GSE能夠顯著降低細菌和真菌的生物多樣性，該結果與紫外殺菌處理的香椿的生物多樣性結果基本一致[26]。

ns 為差異不顯著，*P < 0.05，**P < 0.01。

Figure 7 Shannon indexes of bacteria and fungi ofin different treatment groups

圖8 不同處理組的細菌主成分分析

Figure 8 Principal component analysis of bacteria in different treatment groups

圖9 不同處理組的真菌主成分分析

Figure 9 Principal component analysis of fungi in different treatment groups

為了全面了解不同GSE濃度處理的香椿在貯藏期間的細菌和真菌的整體變化情況，進行了主成分分析（PCA），結果（圖8和圖9）表明，0.5%GSE處理的細菌和真菌PCA在貯藏期間聚集在一起，而其他處理組的PCA結果較離散，因此，0.5%GSE處理能夠有效地控制和保持香椿在貯藏過程中的細菌和真菌生物多樣性的穩定。

3 結論

本研究以二茬香椿為原料，采用不同濃度的葡萄柚籽提取物（GSE）和聚乙烯（PE）包裝對其進行保鮮處理，并測定其貯藏期間的菌落總數、霉菌酵母菌數及細菌和真菌的生物多樣性。本試驗從微生物數量和多樣性的角度探討GSE改善香椿貯藏保鮮品質的原因。試驗結果表明，0.5%GSE結合PE保鮮膜處理組能夠有效地抑制菌落總數以及霉菌酵母菌數的增長；優勢細菌門為藍菌門（）和變形菌門（），優勢細菌屬為產堿菌屬（）和紅色桿菌屬（）；優勢真菌門為子囊菌門（）和擔子菌門（），優勢真菌屬為短梗霉屬（）和斯賓塞馬丁氏孢菌屬（）；香農指數和主成分分析結果表明，0.5%GSE結合PE保鮮膜處理組的細菌和真菌生物多樣性最低，微生物群落的多樣性更加穩定，從而保證了香椿的貯藏品質和安全。

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Effects of grapefruit seed extract and polyethylene packaging on microbial changes ofduring storage

LIN Shaohua1, Ayitula·Baigetumuer2, CHEN Cunkun3, ZHANG Huijie4, LUO Hongxia1, LI Xiangyang2, XU Wentao5

(1. Department of Food and Biological Engineering, Beijing Vocational College of Agriculture, Beijing 102442;2.Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue, Faculty of Food Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206; 3. National Engineering Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products, Key Laboratory of Storage of Agricultural Products, Ministry of Agriculture and Rural Affair, Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products, Tianjin 300384;4. College of Food Engineering and Biotechnology, State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457; 5. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, China Agricultural University, Beijing 100083)

Because of its short picking period and strong seasonality,is easy to rot and deteriorate. In this study, the second crop ofwas used as the raw material, and different concentrations of grapefruit seed extract (GSE) and polyethylene (PE) packaging were used for preservation treatment. The total number of colonies, the number of molds and yeasts and the biodiversity of bacteria and fungi were determined during storage. The results showed that 0.5% GSE combined with PE preservative film could effectively inhibit the growth of the total number of colonies and the number of molds and yeasts; the dominant phylum of bacteria wereand; the dominant genus of bacteria wereand; the dominant phylum of fungi wereand; the dominant genus of fungi wereand. The results of Shannon index and principal component analysis showed that 0.5% GSE combined with PE film had the lowest diversity of bacteria and fungi, and the microbial community was more stable.

grapefruit seed extract; polyethylene packaging;; storage and preservation; microorganism

TS255.3

A

1672-352X (2021)03-0367-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.016

2021-7-7 10:07:22

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1648.032.html

2020-07-28

北京市財政支持特高校建設專項-科技小院建設項目（PXM2020-157102-000028），食品營養與安全應用技術協同創新中心項目（PXM2021_157102_000005）和萬人計劃教學名師特殊支持項目（2020-00808）共同資助。

林少華，副教授。E-mail：lsh_hp@sina.com

羅紅霞，博士，教授。E-mail：hongxiajun@163.com 李相陽，博士，副教授。E-mail：lxy2002cn@163.com