不同來源蟬棒束孢遺傳異質性研究

陳名君，魯林琴，林 儼，劉玉軍，謝繼宇

不同來源蟬棒束孢遺傳異質性研究

陳名君1，魯林琴1，林 儼1，劉玉軍2，謝繼宇1

(1. 安徽農業大學微生物防治省重點實驗室，合肥 230036；2. 安徽省科學技術研究院，合肥 230031)

蟬棒束孢是一種昆蟲病原真菌，也是傳統的中藥材料，廣泛分布于世界各地。利用ISSR-PCR分子標記技術對采集自不同地理位置的42株蟬棒束孢遺傳異質性進行分析，9個引物共得到141個特異性條帶，其中多態位點比率為94.7%。從種群水平上來看，宣城敬亭山種群（Pop A）的遺傳多樣性最高，達到81.6%，安徽石臺縣種群(Pop F)的遺傳多樣性最低，只有27.0%。其中種群內遺傳多樣性（）為0.216 8，Nei 基因分化系數（）為0.276 3，不同地方的種群間的平均基因流（）較大，為1.309 8。研究表明，蟬棒束孢遺傳譜系是隨機分布的，與地理來源沒有明顯的相關性，不同地理來源的種群間較高水平的基因交流是種群遺傳變異的主要原因。

蟬棒束孢；ISSR分子標記；遺傳結構；遺傳異質性

蟬棒束孢（Miquel）是寄生于蟬若蟲后形成的蟲菌復合體，俗稱蟬花，屬于子囊菌門（）肉座菌目（）蟲草科（）棒束孢屬（）一種真菌[1]。是一種昆蟲病原真菌型中藥，具有很好的藥用價值。從古自今，很多書中都記載了蟬棒束孢作為中國著名的中藥，具有多方面的藥用價值[2]?，F代中醫學發現，蟬花對慢性腎衰竭等多種疾病有明顯療效[3-4]。蟬棒束孢在我國主要分布于長江以南各省份，在竹林、闊葉林和針、闊葉混交林都有分布[5]。作為昆蟲病原真菌，蟬棒束孢可侵染同翅目（）[6]和鱗翅目（）[7]等多種昆蟲，具有良好的生物控制效果。

蟬棒束孢世界廣布，產地眾多，在生境、形態、化學成分和核酸水平等多個層次都具有多樣性[1]。李建平等[8]研究了不同居群蟬棒束孢的形態多樣性，研究發現蟬棒束孢形態特征在居群內個體間變異豐富；何亞瓊等[9]研究了人工培養柞蠶蟬花不同部位的代謝組差異，結果發現柞蠶蟬花不同部位的代謝物顯著不同，其蟲體表面菌絲次生代謝產物較多。張勝利等[10]研究了引起蟬若蟲地方病的蟬棒束孢種群遺傳結構，結果表明3個地方病種群均表現出較高的遺傳多樣性。ISSR分子標記技術具有引物設計容易、操作簡單、多態性好、可重復性高等優點[11]。張海燕等[12]利用ISSR分子標記分析了江西省6個地區90株金龜子綠僵菌的種群遺傳結構，可將研究的菌株分成3個來源復雜的分支。但關于不同地理來源的蟬棒束孢遺傳異質性的研究鮮見報道，故作者希望通過本研究來為今后研發利用蟬棒束孢提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株及其培養

供試的42株蟬棒束孢菌株來自11個不同地點，對各菌株的編號、采集地點和寄主等信息詳見表1。

表1 供試蟬棒束孢菌株的采集地點、采集時間、寄主、編號

將蟬棒束孢菌株接種于SDAY（葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、酵母粉10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL）培養基上，在25 ℃的培養箱中培養14 d左右，記錄菌落顏色、形狀和質地。待產孢后，顯微鏡下觀察產孢結構及分生孢子形態和大小，并拍照記錄。

1.2 菌株DNA提取和ISSR擴增

將供試菌株接種于鋪有玻璃紙的SDAY培養基上，于25 ℃恒溫培養箱中培養3 d，待長出大量菌絲后用CTAB法提取總DNA[13]。

ISSR引物篩選及ISSR-PCR擴增，參考張勝利等[10]方法，所用引物如表2所示。

1.3 ISSR數據分析

根據電泳圖譜的遷移率不同來識別多態性條帶，利用BandScan V5.0軟件進行電泳條帶遷移率分析，把同一遷移率的帶看為公共帶，分別記為“1”(代表顯性基因)和“0”(代表隱性基因)。多態位點百分率（）、Shannon信息多樣性指數、實際觀察等位基因數和有效等位基因數（）、遺傳分化系數等分析方法參考文獻[14]。利用NTSYSpcversion2.10e軟件進行遺傳相似系數與遺傳距離分析，并通過非加權法（UPGMA）對數據矩陣進行聚類及主坐標分析[15]。

表2 ISSR擴增所用引物及其核苷酸序列

2 結果與分析

2.1 蟬棒束孢形態和顯微特征

蟬棒束孢孢梗束直立，簡單或近頂部不規則分枝，常棒狀，從覆被寄主蟬的白色至淡黃色菌絲體長出，近頂部由于產生分生孢子呈粉狀或叢卷毛狀，乳白色至淡黃褐色[16]。在SDAY培養基上，菌落生長速度較快，菌落正面蓮子白到淺黃色，絨毛狀，表面有明顯輪紋；約7 d左右產孢，14 d時大量產孢，菌落呈粉狀；培養后期表面有水珠滲出。菌絲管狀，有隔，壁光滑，粗約0.9～2.1 μm。分生孢子梗分支，呈輪狀，粗約1.1～2.1 μm，其上2～5個瓶梗成輪狀排列。瓶?；慷酁榍蛐闻虼?，向上形成粗約0.5 μm的頸部。瓶梗向基式產生分生孢子鏈，分生孢子柱形、單胞、壁光滑、無色、透明、多對稱、少彎曲，大小為3.5～6.5 μm × 1.5～3.5 μm。

1和2. 蟬棒束孢標本；3. 菌落正面；4. 產孢結構，5和6. 成熟孢子；標尺 Bar = 10 μm。

Figure 1 Morphological and microscopic characteristics of

表3 供試引物及其擴增特性

注：表中數值為平均值±標準差。下同。

2.2 不同采集地蟬棒束孢遺傳異質性分析

2.2.1 蟬棒束孢ISSR擴增產物的多態性 由表3可以看出，以本次實驗所篩選出的9個ISSR擴增引物對42株蟬棒束孢菌株的ISSR-PCR擴增反應，均能得到清晰、結果穩定的條帶。不同的引物擴增出來的條帶數量不一樣，可見ISSR引物對蟬棒束孢菌株的特異性不同。本實驗一共擴增得到141個特異性條帶，平均每個引物擴增15.5個條帶。9個引物擴增的條帶的平均多態性為94.7%，其中引物M10擴增的條帶多態性最低（84.2%），5個引物M8、P10、P12、P18和P19 的多態性高達100%。平均基因多樣性指數范圍為0.20～0.33，Shannon 信息指數范圍為0.32～0.49。圖2為引物M11的ISSR-PCR圖譜。

2.2.2 蟬棒束孢地方遺傳多樣性分析 結合表1，根據實驗數據結果分析（表4），42株蟬棒束孢從種群水平上看，遺傳多樣性從大到小依次是：宣城敬亭山種群（Pop A）最高，達到81.6%，其次是安徽牯牛降76.6% (Pop B)，再次是福建明溪縣61.0% (Pop G)、安徽金寨縣49.7% (Pop C)、安徽霍山縣39.7% (Pop D)和安徽潛山市37.6% (Pop E)，安徽石臺縣種群(Pop F)的種群遺傳多樣性最低，只有27.0%。

圖2 引物M11的ISSR-PCR圖譜

Figure 2 ISSR-PCR profiles ofsamplesby primer M11

表4 不同地理來源蟬棒束孢遺傳多樣性分析

：觀察等位基因數；：有效等位基因數；：基因多樣性指數；I：Shannon信息指數；：多態位百分率。

2.2.3 UPGMA聚類分析 采用UPGMA法分析不同采集地蟬棒束孢菌株遺傳相似系數。結果（圖3）顯示，其相似系數在0.56～0.94之間，具有很高的遺傳異質性。本實驗以0.75處為分界線，將42株蟬棒束孢菌株的聚類圖分為了8個分支。分支Ⅰ包括采集自宣城敬亭山菌株編號1、2、4、7和10；采集自安徽牯牛降菌株編號12、16、18、19、20、21和22；采集自安徽金寨菌株編號25；采集自安徽霍山菌株編號27；采集安徽潛山菌株編號30；采集自福建明溪菌株編號34和36和采集自安徽岳西菌株編號為42，共18個菌株。分支Ⅱ只有采集自黃山風景區菌株編號39的1個菌株。分支Ⅲ包括采集自宣城敬亭山菌株編號5和8；采集自牯牛降菌株編號17；采集自安徽金寨縣菌株編號23、24和26；采集自安徽石臺菌株編號31、32和33；采集自福建明溪菌株編號37和38 和采集自滁州瑯琊山菌株編號41共12個菌株。分支Ⅳ為采集自牯牛降菌株編號為11的1個菌株。分支Ⅴ為采集自宣城敬亭山菌株編號為6和9；采集自福建明溪菌株編號35和采集自廣西貓兒山菌株編號為40，共4個菌株。分支Ⅵ有采集自牯牛降菌株編號13、14和15和采集自安徽霍山菌株編號為28，共4個菌株。分支Ⅶ只有采集宣城敬亭山菌株編號為3的1個菌株。分支Ⅷ只有采集自安徽潛山菌株編號為29的1個菌株。由圖3可見，部分采集地蟬棒束孢的親緣關系較近，聚為一群，其中采集自安徽牯牛降菌株編號18和19菌株相似系數最大，可見它們的親緣關系最近。但總體來看，42株蟬棒束孢并沒有完全根據地理位置聚集，各個種群的譜系分布是隨機的，這說明了蟬棒束孢種群間存在較少的遺傳變異。

圖3 基于遺傳相似系數的UPGMA聚類圖

Figure 3 The UPGMA clustering map based on genetic similarity coefficient

2.2.4 蟬棒束孢種群遺傳分化的比較分析 用POPGENE 32 計算出的遺傳變異結果（表5）顯示：蟬棒束孢種群間存在一定程度的遺傳分化，7個種群的遺傳多樣性為0.299 6，其中種群內遺傳多樣性（）為0.216 8，基因分化系數（）為0.276 3，表明有27.63%的遺傳變異存在于種群之間，有72.37%的遺傳變異存在于種群內部，種群間的遺傳分化要小于種群內部的分化[17]。不同地方的種群間的平均基因流（）較大，為1.309 8?？梢娤s棒束孢從不同地理位置分散出去而導致不同種群之間基因交流的頻率較大，從而導致蟬棒束孢種群遺傳分化程度與地理位置沒有一定的關聯性。

表5 蟬棒束孢種群基因多樣性Nei’s分析

: 總基因多樣性；: 種群內基因多樣性；: 基因分化系數；: 基因流。

3 討論與結論

蟬棒束孢（蟬花）是我國傳統的名貴中藥材，在我國已有至少1 500多年的應用歷史[18]。然而長期以來，蟬花的分類學地位幾經變動，常與一些相近種相混淆，導致其分類狀態比較混亂，嚴重限制其開發利用，目前已有多位學者致力于梳理修正其正確的分類地位[1]。蟬棒束孢全球廣布，其產地、生境、形態眾多，呈現出較為豐富的多樣性。其野外標本形態特征呈現一定的多樣性，多數蟬棒束孢孢梗束從寄主頭部直立長出，簡單或近頂部不規則分枝，常棒狀，偶有頭狀，多數為乳白色至淡黃褐色；寄主多為蟬若蟲，偶見蟬成蟲。遺傳異質性和遺傳分化是物種保護的基礎，物種在自然進化過程中，遺傳異質性越高，遺傳變異越豐富，說明物種對環境的適應力越強，反之則對環境的適應力越弱[19]。一個物種或種群所包含的遺傳多樣性越高，它對環境的適應能力就越強。本實驗通過ISSR-PCR分子標記技術對采集自不同地理位置的42株蟬棒束孢進行遺傳異質性分析。結果共擴增出141個特異性條帶，9個引物擴增的條帶平均多態性為94.7%，其中5個引物擴增的條帶多態性高達100%?？梢?，ISSR-PCR分子標記技術是研究蟬棒束孢遺傳異質性的一種高效方法。

根據不同采集地，將42株蟬棒束孢劃分為不同的種群。從種群水平上分析，其中宣城敬亭山種群（Pop A）的遺傳異質性最高，達到81.6%，安徽石臺縣種群(Pop F)的種群遺傳多樣性最低，只有27.0%?？梢?，部分蟬棒束孢種群遺傳異質性較低，這可能與人為活動頻繁、生態環境破壞嚴重有關。因此，需要對該種群進行人為保護，促進該種群與其他種群的基因交流。利用UPGMA法分析不同采集地蟬棒束孢菌株遺傳相似系數，42株蟬棒束孢并沒有完全根據地理位置聚集，各個種群的譜系分布是隨機的，這說明了蟬棒束孢種群間存在較少的遺傳變異。蟬棒束孢種群間存在一定程度的遺傳分化，7個種群的遺傳多樣性為0.299 6，其中種群內遺傳多樣性（）為0.216 8，基因分化系數（）為0.276 3。不同地方的種群間的平均基因流（）較大，為1.309 8?？梢娤s棒束孢從不同地理位置分散出去而導致不同種群之間基因交流的頻率較大，蟬棒束孢遺傳變異和地理來源沒有相關性，這一結論與張勝利等[10]研究結果一致。本次實驗探究了不同采集地蟬棒束孢的遺傳異質性以及種群結構，闡明蟬棒束孢種群內和種群間的遺傳異質性和基因流等信息，警示人們在合理利用蟬棒束孢的同時，應該重視對環境的保護，減少對自然環境的破壞，保護蟬棒束孢的遺傳多樣性，維持自然平衡。

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Study on genetic heterogeneity offrom different sources

CHEN Mingjun1, LU Linqin1, LIN Yan1, LIU Yujun2, XIE Jiyu1

(1. Anhui Provincial Key Laboratory of Microbial Control, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;2. Anhui Academy of Science and Technology, Hefei 230031)

is a kind of entomopathogenic fungus and a traditional Chinese medicinal material, which is widely distributed in the world. By the method of ISSR-PCR, the genetic heterogeneity of 42isolates from different collection sites was analyzed. A total of 141 loci were obtained with 9 ISSR primers, and the percentage of polymorphic loci was 94.7%. From the level of population, the genetic heterogeneity of Jingting Mountain population (Pop A) was the highest (81.6%), while the genetic heterogeneity of Shitai County population (Pop F) was the lowest (27.0%). The gene diversity () within the population was 0.216 8, Nei’s gene differentiation coefficient () was 0.276 3, and the average gene flow () was 1.309 8. The results suggested that the genetic heterogeneity ofis randomly distributed, and there is no obvious correlation with geographical origin. The high level of gene exchange among populations from different geographical origins is the main reason for the genetic variation of the population.

; ISSR molecular marker; genetic structure; genetic heterogeneity

S476.12

A

1672-352X (2021)03-0452-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.020

2021-7-7 9:56:58

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1659.040.html

2020-10-12

2019年省級大學生創新創業訓練計劃項目，安徽農業大學2020年度研究生創新基金項目（2020ysj-21）和合肥市博士后工作站科研活動經費項目（2018HFB021）共同資助。

陳名君，副教授。E-mail：chenmingjun2005@126.com