低乙醛啤酒酵母風味優勢菌株的選育

官 鈺，劉春鳳，李 崎，賀秀麗，謝 鑫，郭立蕓，王金晶*

低乙醛啤酒酵母風味優勢菌株的選育

官 鈺1, 2，劉春鳳1, 2，李 崎1, 2，賀秀麗3，謝 鑫3，郭立蕓3，王金晶1, 2*

(1. 江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；2. 江南大學生物工程學院，釀酒科學與工程研究室，無錫 214122；3. 北京燕京啤酒股份有限公司技術中心，啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京 101300)

啤酒發酵過程中的乙醛主要由啤酒酵母代謝產生，其含量極大地影響啤酒的風味和品質。目前已有大量研究通過選育啤酒酵母來降低啤酒中乙醛含量，但由于大部分采用了分子手段或不符合食品安全條件的方式，尚未真正投入到啤酒的實際生產應用中去。本研究中，以啤酒企業提供的啤酒酵母YJ為出發菌株，經過常壓室溫等離子體誘變（Atmospheric and room temperature plasma, ARTP）處理，雙硫侖平板初篩，搖瓶發酵復篩，獲得了遺傳穩定性和發酵穩定性良好的低產乙醛誘變菌株S48，進而在啤酒工廠進行100 L小試的發酵驗證。結果發現，與出發菌株相比，誘變菌發酵的啤酒樣品中乙醛含量降低了23.69%，其酒精度有所提高，苦味質、總酸和雙乙酰含量更低，主要風味物質無較大差異，醇酯比及感官分析結果更加協調。

酵母；乙醛；ARTP；雙硫侖；啤酒

乙醛是影響啤酒風味組成和風味穩定性最重要的醛類化合物，同時也是酒精飲料中引起人類致癌的物質之一[1-2]。啤酒中乙醛含量過高時會帶來不愉快的青蘋果味、青草味和氧化味等，造成消費者口感的不協調，進一步引起“上頭”等不適生理反應[3-4]。另外，乙醛也是啤酒中許多低閾值成分的前體，如雙乙酰和乙偶姻[5]。一般優質成熟的工業啤酒中乙醛含量在2～10 mg·L-1[6]。

在啤酒的發酵和成熟過程中，啤酒酵母是乙醛的主要來源[7]。葡萄糖代謝所產生的丙酮酸，一部分轉化為乙酰輔酶A進入TCA循環，另一部分經丙酮酸脫羧酶催化生成乙醛[8]。乙醛可以在乙醇脫氫酶的作用下生成乙醇，或在乙醛脫氫酶的作用下生成乙酸，從而進一步被代謝消耗[9]。抑制劑在菌種篩選的過程中有著廣泛的應用，雙硫侖能有效抑制乙醛脫氫酶的活性，利用雙硫侖-乙醇平板能夠有效篩選到具有高乙醛脫氫酶活性的酵母菌[10]。

常壓室溫等離子體誘變(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)是近年來利用在大氣壓下產生的，溫度在25～40 ℃之間，具有高活性粒子濃度的等離子體射流的新型誘變技術，具有操作簡便、設備簡單、條件溫和、安全性高及誘變快速等優良特性[11-12]。對啤酒酵母等真菌的誘變會比常規的紫外誘變效果更加明顯，且誘變菌能夠被用于食品行業的生產[13]。本研究以雙硫侖作為抑制劑結合ARTP誘變技術，對燕京啤酒提供的出發菌株進行誘變和篩選，以期獲得發酵性能優良的低產乙醛的啤酒酵母菌株，并能成功投入工業啤酒生產的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 啤酒酵母（）YJ，啤酒企業提供；啤酒酵母（）S48 ARTP誘變獲得。

1.1.2培養基 麥汁培養基：14 oP麥汁（糖化料水比為1∶4，糖化過程為：48 ℃, 30 min → 63 ℃, 60 min → 72 ℃, 30 min → 78 ℃, 10 min。

雙硫侖-乙醇培養基（g·L-1）：乙醇，20；雙硫侖，0.000 4；(NH4)2SO4，5；KH2PO4，1；NaCl， 0.1；MgSO4·7H2O，0.1；CaCl2，0.1；酵母膏，0.1；121 ℃滅菌 20 min。

酵母培養基（g·L-1）：酵母浸出粉，10；蛋白胨，20；葡萄糖，20；115 ℃滅菌15 min。

乙醛培養基（g·L-1）：(NH4)2SO4， 5；KH2PO4， 1；NaCl，0.1；MgSO4·7H2O，0.1；CaCl2，0.1；酵母膏，0.1；121 ℃滅菌 20 min，加乙醛0.1（膜過濾除菌后，加入滅菌后的培養基中）。

1.1.3試劑 麥芽，中糧集團有限公司；酵母浸出粉、蛋白胨和瓊脂粉，生工生物工程(上海)股份有限公司；無水葡萄糖、無水乙醇、(NH4)2SO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O和CaCl2國藥集團化學試劑有限公司；乙醛(色譜純)，阿拉丁試劑(上海) 有限公司；3-庚酮(色譜純)，Sigma-Aldrich公司；雙硫侖，Alorich化學試劑公司；Alcohol Dehydrogenase Assay Kit，Bio Vision公司；乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測試劑盒，上海索萊寶生物科技有限公司。標準溶液包括乙醛和3-庚酮等。

1.1.4 儀器與設備 超凈臺(SW-CJ-2FD)，蘇凈集團安泰公司；高壓滅菌鍋(HVE-50)，日本Hirayama公司；紫外可見分光光度計(UV-2000)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；顯微鏡(CX21FS1) ，日本Olympus公司；阿貝折光儀，上海豫光儀器有限公司；頂空氣相色譜儀(GC-2010)，日本島津(Shimadzu)公司；ARTP—II型常壓室溫等離子體誘變系統，無錫源清天木生物科技有限公司；臺式冷凍離心機(5804 R)，德國Eppendoff公司；磁力攪拌器(81-2) ，上海司樂儀器有限公司；生化培養箱(SPX-250)，上海躍進醫療器械有限公司；電熱恒溫水浴鍋(HHS) ，生化培養箱(BSP-250)上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 方法

1.2.1 啤酒發酵 用接種環挑取啤酒酵母菌株于10 mL 14 oP麥汁試管中，28 ℃培養36 h后轉接1 mL菌液于100 mL 14 oP麥汁三角瓶中（隨發酵體系的增大，種子液的培養量適當增加），28 ℃培養36 h后放置22 ℃恒溫沉降6 h，再轉入15 ℃恒溫培養箱靜置6 h，取適量酵母泥接種至準備好的麥汁三角瓶中，接種量約為1×107CFU·mL-1。搖勻后塞上發酵栓，用無菌水液封發酵栓后11 ℃發酵7 d。

1.2.2 ARTP誘變選育 從斜面上取啤酒酵母于10 mL酵母培養基(YPD)試管中活化，36 h后轉接1 mL菌液于100 mL YPD三角瓶中培養至對數生長中期。取適量菌液于EP管中12 000 r·min-1離心1 min，棄上清后用生理鹽水洗滌，12 000 r·min-1離心1 min后重復洗滌離心1次，用生理鹽水稀釋至OD600為1，再將其進一步稀釋10倍。

將10 μL稀釋好的菌液均勻涂布在ARTP載片上，以高純的氦氣作為ARTP的工作氣源，設置電源功率100 W，氣體流量10 SLM固定不變，調整好每個載片的誘變時間，等離子照射處理后將載片投入含有生理鹽水的EP管中，加入適量YPD液體培養基，28 ℃震蕩培養1 h后涂布于相應的平板上。

1.2.3 乙醛馴化 將誘變菌于10 mL YPD培養基中活化24 h后，取200 μL加入10 mL乙醛培養基中，18 ℃，180 r·min-1搖床培養72 h后取1 mL菌液至新一批乙醛培養基中繼續馴化，如此重復，持續轉接馴化。

1.2.4 乙醛含量的測定 采用頂空氣相色譜法測定啤酒發酵液中乙醛的含量[14]。將發酵液離心后取上清，在頂空瓶中分別添加4 mL發酵液，1 mL 30 mg·L-1的3-庚酮內標和1.8 g NaCl。檢測條件為：FID檢測器溫度為250 ℃；色譜柱初始溫度40 ℃，以10 ℃·min-1的速度升至180 ℃。

1.2.5 發酵液的理化指標檢測 酒精度、原濃、發酵度、苦味值、雙乙酰、殘糖、總酸和pH等發酵液基本理化指標的檢測均參照國標（GB/T4928- 2008）啤酒分析方法進行檢測[15]。

1.2.6 酵母細胞乙醛脫氫酶以及醇脫氫酶的酶活測定 發酵過程中，酵母細胞內的乙醛脫氫酶酶活以及醇脫氫酶酶活采用相應的試劑盒進行檢測，測定方法詳見Alcohol Dehydrogenase Assay Kit、Bio Vision、乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測試劑盒及索萊寶的使用說明。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變

將對數生長中期的啤酒酵母YJ進行ARTP誘變選育，結果（圖1）顯示，隨著離子束照射時間的增長，酵母細胞的存活率迅速下降：當照射時間達到80 s以上時，酵母細胞存活率為零；處理時間為45 s左右，致死率為88.7%。因此我們選定啤酒酵母YJ進行ARTP誘變的照射處理時間為45 s。

采用點樣法確定雙硫侖對YJ的致死濃度，結果（圖2）顯示，在梯度濃度的雙硫侖抑制劑平板上從左至右點樣，菌液濃度分別為107、106、105和104。ARTP誘變過程中，原始涂布于載片的菌液濃度為106，誘變結束后10 μL菌液在生理鹽水中稀釋至1 000 μL體系，菌液體系濃度降低為104。圖2(b)中平板上點樣濃度為104時，區域幾乎已無菌種生長，達到抑制劑所需的致死率要求。最終選擇雙硫侖濃度0.3 mg·L-1為誘變菌篩選平板的抑制劑濃度。

圖1 ARTP誘變啤酒酵母YJ存活率曲線

Figure 1 Survival curve of beer yeast YJ after ARTP mutagenicity

注：圖（a）、（b）和（c）中的平板雙硫侖濃度分別為0.1、0.3和0.5 mg·L-1。

Figure 2 The growth of disulfiram gradient plates by spotting method

表 1 250 mL 14 oP麥汁三角瓶中菌種的產乙醛情況

將啤酒酵母菌株YJ在ARTP儀上誘變處理45 s后，培養1 h左右，稀釋涂布在抑制劑濃度為0.3 mg·L-1的雙硫侖-乙醇平板上，28 ℃培養5 d后，隨機選取了57株誘變菌進行發酵驗證。

2.2 三角瓶發酵實驗

2.2.1 250 mL三角瓶發酵實驗 將ARTP誘變獲得的57株誘變菌株以及出發菌株YJ接入250 mL 14 oP麥汁三角瓶中進行第1批發酵篩選實驗，在11 ℃恒溫培養條件下發酵7 d，結束后取樣，采用頂空氣相色譜法測定啤酒發酵液中乙醛的含量，每組兩個平行樣品，所得結果數據如表1所示。與出發菌株YJ發酵液中乙醛含量檢測結果相比，57株誘變菌株中，有44株菌株乙醛產量低于出發菌株，誘變菌株的正向突變率較高，約為77%。

2.2.2 500 mL三角瓶發酵實驗 選取表1中發酵液乙醛含量較低的的10株誘變菌株（S6、S11、S14、S24、S45、S46、S47、S48、S52和S55）以及出發菌株YJ接入含有14 oP麥汁的500 mL三角瓶進行第2批發酵篩選，相同條件發酵結束后取樣檢測發酵液乙醛含量，結果如圖3(a)所示。第2批發酵實驗的10株誘變菌株中，有8株誘變菌株的乙醛產量低于出發菌株，其中誘變菌株S47和S48的乙醛產量最低。

圖3 500 mL（a）以及3 L（b）三角瓶發酵產乙醛情況

Figure 3 Acetaldehyde production of 500 mL 14 oP wort (a) and 3 L 14 oP wort (b) fermentation

表2 3次三角瓶發酵篩選實驗中YJ與S48的產乙醛情況對比

表3 成品酒理化指標檢測結果（貯酒9 d）

2.2.3 3 L三角瓶發酵實驗 研究進一步選取S47以及S48進行第3批3 L 14 oP麥汁三角瓶發酵實驗，結果如圖3(b)所示，誘變菌株S47和S48的發酵液中乙醛含量較出發菌株分別降低了18.50%和24.37%。因此，最終選擇誘變菌株S48進行工廠小試。

表4 成品酒主要風味物質檢測結果（貯酒9 d）

啤酒發酵過程中，乙醛在主發酵3 d左右大量產生，由于酵母數量的急劇增加，代謝旺盛，乙醛大量積累而達到峰值，但隨著發酵的繼續，罐內壓力升高，乙醛含量急劇下降。發酵結束后的乙醛的含量受麥汁質量、溶氧量、酵母細胞數及后發酵過程代謝等眾多因素的影響，因此無法根據絕對值判斷誘變菌株的降乙醛能力，需要通過與出發菌株比較的相對值來判斷[16-17]。如表2所示，在3次發酵篩選實驗中，不同批次的發酵液乙醛絕對值均出現波動情況，隨著發酵體系的放大，誘變菌株S48降低乙醛的能力也有所減弱，這是由于放大過程十分復雜，比上游篩選工作所涵蓋的內容體量更大，需要綜合更多的因素加以考慮。

2.3 生產小試

2.3.1 成品酒理化指標檢測 工廠小試發酵結束后貯酒9 d的成品酒理化指標檢測結果（表3）顯示，在誘變菌株S48在原麥汁濃度略低于出發菌株的情況下，酒精度稍有增加，發酵性能有所提升。與此同時，誘變菌株的苦味值、總酸及殘糖量都略有下降，下降比例分別為7.9%、12.3%和54.6%，酒體的口感更加協調。雙乙酰的含量較出發菌株降低了25%。由于雙乙酰含量與乙醛代謝有著密切的關聯，一定條件下可以直接由活性乙醛在乙酰輔酶的作用下縮合而成，其含量的減少也一定程度反映出了誘變菌株乙醛還原能力的提升[18]。

圖4 感官分析雷達圖（貯酒11 d)

Figure 4 Radar chart of sensory analysis (storage for 11 days)

表5 回收酵母泥的主要性能對比

2.3.2 成品酒主要風味物質的檢測 進一步對成品酒中醛類、酯類和醇類主要風味物質組分進行了檢測分析，結果（表4）顯示：與出發菌株YJ相比，誘變菌株S48的成品酒（貯酒9 d）樣品中，乙醛含量降低約23.69%，這表明誘變菌株的乙醛還原能力的確獲得了良好的提升，在100 L的發酵體系中依舊能保持穩定的低產乙醛性能。此外，高級醇和揮發酯兩大類物質是啤酒的重要風味成分，高級醇含量應控制在100 mg·L-1以下，含量過高容易引起“上頭”等不良生理反應[19]。與出發菌株相比，誘變菌株發酵液中，總醇含量降低了15.04%，乙醇含量略有增加，正丙醇、異丁醇和異戊醇等含量均有所降低，說明在未減少乙醇產量的同時，普遍降低了發酵液中的高級醇含量；另一方面，總酯的含量無較大差異，因此誘變菌株S48發酵的成品啤酒中的醇酯比出發菌株降低了15%。

辛酸乙酯具有白蘭地酒香味特征，S48的成品酒發酵液中辛酸乙酯含量升高了40.74%，在增加啤酒的特征香氣方面有一定的幫助[20]。

2.3.3 成品酒感官分析 感官分析雷達圖將科學模型與感官特性相結合，使用心理物理模型以綜合評價酒體的感官體驗[21]。圖4為7位專業國家級品評人員對貯酒11 d的出發菌株YJ以及誘變菌S48兩款成品酒的感官評分雷達圖。由圖4可以看出：S48的麥芽香、酒花香和甜味得分略高于YJ，高級醇味略明顯，殺口感弱于出發菌株YJ；異味方面，兩組均存在硫味，但S48的硫味不及YJ明顯。因此，S48的成品酒感官評定綜合結果更加良好。

2.3.4 回收酵母泥的主要性能對比 從理論上講，發酵性能良好的酵母泥，可一直使用多代。在實際生產過程中，由于酵母菌種本身的變化及外界微生物的污染，隨著酵母使用代數的增加，其發酵性能和活力等會有所降低，而死亡率、衰老比例等會有所上升[22]。一般啤酒廠的優良菌種回收的酵母泥需控制在能連續使用5～7代[23]。

表5展示了YJ以及S48兩組酵母泥的主要性能對比數據。由表5可以看出，兩者的電導率和活力無顯著性差異，誘變菌株S48酵母泥的死亡率和衰老比例顯著低于出發菌株YJ，分別降低了53.3%及46.6%。另外，S48的自溶系數較大，表明其自溶程度較低。在凝聚性方面，S48僅為1.35%，顯著低于YJ（64.88%）。啤酒酵母產生乙醛的能力與凝聚性的關系尚未有研究說明，后續將進一步探究。

2.4 發酵過程中代謝關鍵酶的酶活檢測

在啤酒的發酵過程中，啤酒酵母消耗葡萄糖、麥芽糖等碳源產生的丙酮酸，一部分轉化為乙酰輔酶A進入TCA循環，另一部分經丙酮酸脫羧酶催化生成乙醛。乙醛脫氫酶以及乙醇脫氫酶是乙醛代謝的關鍵酶，能分別將乙醛還原為乙酸和乙醇。雙硫侖能夠有效抑制乙醛脫氫酶的活性，篩選所得誘變菌理論上應具有較高的乙醛脫氫酶酶活，因此我們跟蹤檢測了發酵過程中的乙醛脫氫酶以及醇脫氫酶的活性。從實驗結果（圖5）可知，出發菌以及誘變菌的醇脫氫酶活性水平基本一致，在發酵后期S48略高于YJ，而S48的乙醛脫氫酶活性始終高于YJ，且在發酵第3至第4天的活性較高，符合發酵過程中乙醛含量先增加后減少的趨勢，體現出了雙硫侖作為低產乙醛啤酒酵母篩選抑制劑的有效性。

2.5 遺傳穩定性實驗

傳統誘變方法選育獲得的菌株易為發生優勢性狀的回復突變，其穩定性需要進行長時間的針對性馴化實驗和適宜的保藏方法來維持。研究對S48進行了3個月的乙醛馴化實驗，連續傳代30次后，分別取第0、第5、第10、第15、第20、第25和第30代進行發酵驗證。其乙醛檢測結果（圖6）顯示，經過多次傳代后，菌株S48和YJ的乙醛產量分別穩定在9.84和14.92 mg·L-1，相對出發菌株YJ, S48乙醛產量能維持在降低34%左右，具有良好的遺傳穩定性。

圖5 發酵過程中醇脫氫酶(a)以及乙醛脫氫酶酶活情況(b)

Figure 5 Enzyme activities of alcohol dehydrogenase (a) and acetaldehyde dehydrogenase (b) during fermentation

圖6 遺傳穩定性實驗產乙醛情況

Figure 6 Acetaldehyde production in genetic stability experiments

3 討論與結論

如何降低發酵液中的乙醛含量一直是困擾啤酒行業的重要問題，而啤酒酵母對乙醛代謝起著至關重要的作用[24]。隨著基因工程技術的發展及啤酒酵母基因組的不斷闡明，目前已經有大量的研究采用各類分子手段、逆向代謝工程等方法揭示了啤酒酵母低產乙醛的機理，但在啤酒行業的實際應用方面還存在許多問題[25]。本文采用ARTP的方法，以雙硫侖作為篩選抑制劑，對一株工業化大生產菌株進行誘變處理后，通過多次搖瓶發酵篩選得到的誘變菌株S48，在提高酵母細胞內乙醛脫氫酶的活性，降低發酵液乙醛含量的同時改善了其他風味物質的代謝及啤酒的風味穩定性，經過一定時間的乙醛馴化后，其優勢性狀基本達到穩定遺傳狀態，在啤酒的工業化生產上有著廣闊的應用前景。

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Screening of low-acetaldehyde beer yeast with flavor advantages

GUAN Yu1, 2, LIU Chunfeng1, 2, LI Qi1, 2, HE Xiuli3, XIE Xin3, GUO Liyun3, WANG Jinjing1, 2

(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122; 2. Lab of Brewing Science and Technology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122; 3. Key Laboratory of Brewing Technology in Beijing, Technology Center, Beijing Yanjing Beer Co., Ltd., Beijing 101300)

Acetaldehyde is mainly produced by yeast during beer fermentation, and its modi?cation greatly a?ects beer ?avor and quality. There are a lot of researches about the relationship between low-level acetaldehyde beer and yeast, however, due to the food safety, none of them have been applied to industrial beer production yet. In this study, we mutated the parent strainYJ provided by beer company via ARTP (Atmospheric and room temperature plasma) and used a resistant plate combining disulfiram and ethanol to do the first round screening. Later, we selected the mutant strain S48 by several times of different flask fermentation. Compare with the parent strain, mutant strain (S48) lowered the amount of acetaldehyde by 23.69%, while alcohol was stronger, amaroid, total acid and diacetyl were lower in the factory fermentation tests. The flavor of fermentation liquor was better, and the alcohol with ester was more regulated.

yeast; acetaldehyde; ARTP; disulfiram; beer

TQ926.1; TS261.11

A

1672-352X (2021)03-0511-07

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.005

2021-7-7 10:45:03

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1641.010.html

2020-09-15

國家自然科學基金項目（31601558,315571942）資助。

官 鈺，碩士研究生。E-mail：1020616115@vip.jiangnan.edu.cn

王金晶，副教授。E-mail：jjwang@jiangnan.edu.cn