山奈酚減輕人角質形成細胞氧化應激損傷

鄒雪蓮，胡 雯，雷子賢，王紅娟，徐 晨，哈麗娜·海若拉，康曉靜*

(1.安徽醫科大學 新疆臨床學院，新疆 烏魯木齊830001；2.新疆維吾爾自治區人民醫院 皮膚性病科，新疆 烏魯木齊830001；3.新疆維吾爾自治區科技廳 新疆皮膚病研究重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830001)

白癜風是一種常見的獲得性色素脫失性疾病，氧化應激導致功能性黑素細胞破壞是其發病的關鍵環節[1]。除黑素細胞外，角質形成細胞在白癜風的發生發展中同樣發揮了重要作用[2-3]。核因子E2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)靶向細胞抗氧化損傷的相關基因，研究表明其參與白癜風發病的黑素細胞Nrf2活化缺陷[4]。驅蟲斑鳩菊(Vernoniaanthelmintica(L.)Willd.)是新疆治療白癜風的傳統特色藥物。上世紀70年代，驅蟲斑鳩菊針劑已用于治療白癜風，臨床療效顯著[5]。其化學成分復雜，目前普遍認為黃酮類化合物是發揮治療作用的主要成分。山奈酚(Kaempferol，KP)作為最常見的天然黃酮類化合物，廣泛存在于綠葉蔬菜及韭菜和龍蒿等草本植物中，具有抗氧化、抗癌、抗感染、抗菌等功能[6]。本研究擬探索KP對HaCaT細胞內Nrf2及其下游抗氧化基因的表達影響，明確驅蟲斑鳩菊的抗氧化作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

驅蟲斑鳩菊(新疆烏魯木齊市埃力克維吾爾醫大藥房)由新疆維吾爾自治區藥物研究所鑒定為菊科植物驅蟲斑鳩菊Vernoniaanthelmintica(L.)Willd.的種子。各黃酮類化合物標準品(Sigma-Aldrich和Steraloids公司)；人永生化角質形成細胞系(human immortalized keratinocytes，HaCaT)(中國科學院昆明細胞庫)；山奈酚(kaempferol，KP，分子式：C15H10O6)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽[2,2-azobis (2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH，分子式：C8H18N6·2(HCl)](北京索萊寶科技有限公司)；反轉錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；RT-qPCR試劑盒(Qiagen公司)；Nrf2抗體(Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1 驅蟲斑鳩菊種子總黃酮含量測定及黃酮類物質定量：用60%乙醇溶液對適量混勻的樣品進行兩次超聲提取，濾液并于容量瓶中，即為供試品。取2.0 mL供試品于比色管中，用60%乙醇補充至5.0 mL，依次加入50 g/L亞硝酸鈉、100 g/L硝酸鋁及200 g/L氫氧化鈉后，用60%乙醇定容，搖勻，放置15 min。用1 cm比色皿以相應的不添加100 g/L硝酸鋁的試樣液作為空白進行校正，在波長510 nm處測定吸光度值。根據公式計算樣品中總黃酮含量。取適量供試品于離心管中，離心后取上清，液質聯用分析用Waters ACQUITY UPLC I-Class系統，多反應監測技術質譜分析用Sciex 5500 QTRAP質譜儀，黃酮類物質定量用Analyst軟件。

1.2.2 細胞的分組及處理：將HaCaT細胞分為對照組，AAPH模型組，低、中、高劑量KP干預組。3～5代細胞用于實驗，用含1%雙抗、10%胎牛血清的高糖DMEM培養基對HaCaT細胞進行常規培養，細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中，每2天更換1次培養液，光學顯微鏡下持續觀察細胞，待細胞匯合度為80%～90%且狀態良好時，用胰蛋白酶消化傳代，進行后續實驗。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖：按照每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板中，每孔內加1×103個細胞，設置不同濃度梯度的AAPH(以一定質量粉末直接溶于完全培養基中配制而成)或山奈酚，并設立空白對照，每組5個復孔，置于細胞培養箱中繼續培養一定時間后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h，在酶標儀450 nm處測定吸光度值，計算細胞增殖率。實驗至少重復3次。

1.2.4 不同濃度山奈酚對HaCaT細胞形態的影響：調整細胞為5×105個/mL，以每孔2 mL接種于6孔板中，經不同濃度KP(10、20、30 μmol/L)及AAPH處理后，用倒置相差顯微鏡觀察各組的HaCaT細胞形態學變化。

1.2.5 RT-qPCR檢測細胞中Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和GCLM mRNA水平：常規提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA后進行RT-qPCR檢測。引物設計及合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，Nrf2上游引物：5′-TCCAAGTCCAGAAGCCAA ACTGAC-3′，下游引物：5′-GGAGAGGATGCTGCTG AAGGAATC-3′；血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1，HO-1)上游引物：5′-TGCCAGTGCCACCAAGTTCA AG-3′，下游引物：5′-TGTTGAGCAGGAACGCAGTCT TG-3′；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinone dehydrogenase 1，NQO1]上游引物：5′-GTCGGCAGAAGAGCACTGATCG-3′，下游引物：5′-ACTCCACCACCTCCCATCCTTTC-3′；谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC)上游引物：5′-CT TTCTCCCCAGACAGGACC-3′，下游引物：5′-CAAGG ACGTTCTCAAGTGGG-3′；谷氨酸-半胱氨酸連接酶調節亞基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit，GCLM)上游引物：5′-TGCTGTGTGATGCCACCAGA TTTG-3′，下游引物：5′-GTGCGCTTGAATGTCAGG AATGC-3′；內參GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGA TCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTC ATACTTCTCATGG-3′。

1.2.6 Western blot檢測Nrf2蛋白表達：收集各組細胞，以RIPA裂解液裂解并提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白含量后，95 ℃蛋白變性10 min，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Nrf2一抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，次日二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，增強化學發光法(ECL)顯色并拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 驅蟲斑鳩菊種子代謝物標準品XIC圖

黃酮類物質標準品的XIC圖顯示各代謝物的色譜分離較好，峰形尖銳對稱，相關系數均大于0.99，能夠對各代謝物進行質譜定量。

2.2 驅蟲斑鳩菊類黃酮物質定量結果

通過乙醇萃取法測定驅蟲斑鳩菊種子總黃酮類物質含量為0.97 g/100 g。定量分析共獲得36種合類黃酮化合物，其中異黃酮和黃酮苷類各9種，黃烷類7種，黃酮類5種，O-甲基化類黃酮查爾酮和羥基肉桂酸各2種，二氫查爾酮類和黃烷酮類各1種。以黃烷類化物圣草酚含量最高，為12 651 ng/100 g。KP含量為63 ng/100 g。保留時間最短的為黃烷類化合物(-)-表沒食子兒茶素，保留時間為2.76 min；最長的為異黃酮化合物葛根素，保留時間為10.81 min。KP保留時間為9.07 min。驅蟲斑鳩菊種子主要黃酮類物質定量結果見表1。

表1 驅蟲斑鳩菊種子中主要黃酮類物質含量Table 1 Contents of main flavonoids in the seeds of Vernonia anthelmintica (L.)Willd.

2.3 CCK-8法檢測AAPH和KP對HaCaT細胞增殖的影響

AAPH呈劑量依賴性抑制細胞增殖(P<0.001)，選擇25 mmol/L作為本實驗的造模濃度，此時細胞存活率為(62.33±4.98)%(圖1A)。KP濃度為0～40 μmol/L時，未見明顯細胞毒性。安全劑量的KP可減輕AAPH導致的細胞損傷，隨著山奈酚濃度的升高，HaCaT細胞存活率逐漸恢復(P<0.05)(圖1C)。故后續實驗選擇10、20、30 μmol/L為KP低、中、高劑量組(細胞存活率分別為77.86%±0.79%、84.01%±2.80%和89.42%±3.01%)(圖1)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with model group圖1 CCK-8檢測AAPH和KP對HaCaT細胞增殖的影響Fig 1 CCK-8 detection of the effects of AAPH and KP on the proliferation of HaCaT cells

2.4 不同濃度KP對HaCaT細胞形態學的影響

對照組細胞形態近似梭形或多角形，邊緣清晰，樹突多。模型組細胞形態略偏橢圓形或圓形，邊緣模糊，貼壁細胞數量減少。不同濃度的KP干預HaCaT細胞后，細胞形態在一定程度上得到恢復(圖2)。

A-E.control group;model group;low-,medium-,high-dose KP intervention groups圖2 不同濃度KP對HaCaT細胞的形態學影響Fig 2 Effects of different concentrations of KP on morphology of HaCaT cells (×100)

2.5 KP對HaCaT細胞內Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC及GCLM mRNA表達的影響

與對照組相比，25 mmol/L AAPH可增加細胞內Nrf2、HO-1、GCLC和GCLM mRNA的表達水平；與模型組相比，低劑量KP可增加HaCaT細胞內Nrf2、HO-1和GCLC mRNA表達水平，高劑量KP僅增加細胞內Nrf2 mRNA表達水平。其中低劑量KP對HO-1的影響最為顯著，表達增量為對照組的48倍、模型組的4倍(圖3)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with model圖3 KP對HaCaT細胞Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC及GCLM mRNA表達的影響Fig 3 Effects of KP on the expression of Nrf2,HO-1,NQO1,GCLC and GCLM mRNA in HaCaT cells

2.6 KP對HaCaT細胞內Nrf2蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組HaCaT細胞內Nrf2蛋白表達增加(P<0.05)。與模型組相比，不同劑量KP可呈濃度依賴性增加細胞內Nrf2蛋白表達(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with model圖4 KP對HaCaT細胞Nrf2蛋白表達的影響Fig 4 Effect of KP on the expression of Nrf2 protein in HaCaT cells

3 討論

驅蟲斑鳩菊為菊科Compositae斑鳩菊屬一年生草本植物，目前對這一傳統藥物的研究多局限在總黃酮提取層面，黃酮類單體的研究相對較少。本實驗測定驅蟲斑鳩菊種子總黃酮類物質含量為0.97 g/100 g，共獲得36種黃酮類化合物，是目前國內對驅蟲斑鳩菊種子中黃酮類物質種類鑒定最多的一次報道。KP是驅蟲斑鳩菊黃酮類化合物中生物利用度最高的一種單體，可顯著增加黑素合成基因的表達并提高酪氨酸酶活性[7]，提示KP是驅蟲斑鳩菊發揮治療作用的一種有效成分。本實驗明確KP在驅蟲斑鳩菊種子中的定量，為62.96 ng/100 g。AAPH是可靠的氧化應激造模藥物，其與HaCaT細胞共同構建的體外氧化應激模型更加經濟有效且易于重現，適用于多種氧化應激相關皮膚疾病的病理研究[8]。本實驗以AAPH刺激HaCaT細胞模擬白癜風體外氧化應激，用不同濃度KP對細胞進行預處理，結果表明KP可以保護HaCaT細胞對抗AAPH誘導的細胞損傷。

Nrf2是保護細胞免受氧化損傷的關鍵轉錄因子[9]。氧化應激時，Nrf2與伴侶蛋白解偶聯并快速轉移入核，與細胞內的抗氧化反應元件結合，啟動下游抗氧化基因的表達，提高細胞對氧化損傷的抵抗性。這些基因主要包括HO-1、NQO1、GCLC與GCLM。其中HO-1的上調可極大提高細胞對氧化損傷的保護作用[10-11]。健康人黑素細胞的體外氧化應激模型中Nrf2及下游抗氧化基因的mRNA和蛋白表達增加[12-13]。本實驗在HaCaT細胞的體外氧化應激模型中得到了同樣的結果。KP在體外具有極強的抗氧化活性，可直接清除活性氧簇，激活Nrf2/HO-1通路[14]，提示KP是一種Nrf2激活劑。與之一致，本研究發現KP可增加HaCaT細胞內Nrf2 mRNA和蛋白表達，且呈濃度依賴性；同時本研究發現低劑量KP可顯著增加HO-1 mRNA表達，提示KP可能通過調控Nrf2/HO-1抗氧化信號通路發揮作用，尚需進一步實驗驗證。

綜上所述，本研究表明驅蟲斑鳩菊成分KP能上調Nrf2的表達，從而減輕AAPH誘導的HaCaT細胞氧化應激損傷。同時，本研究表明驅蟲斑鳩菊在抗氧化應激方面也具有一定的應用前景，有希望成為氧化應激相關疾病的治療用藥。