人羊膜間充質干細胞無血清培養方法的建立

劉曉玉，施 萍，潘伯臣*，龐希寧2,*

(1.中國醫科大學附屬盛京醫院 生殖醫學中心,遼寧 沈陽 110004；2.中國醫科大學 干細胞與再生醫學研究室,遼寧 沈陽 110122；3.沈陽艾米奧生物工程技術研發中心有限公司,遼寧 沈陽 110015)

間充質干細胞具有自我更新，多向分化潛能及旁分泌作用，是組織工程重要的種子細胞[1]。人羊膜來源的間充質干細胞(human amnion mesenchymal stem cells，hAMSCs)取材于臨床廢棄的羊膜組織，同時具備易獲得、可塑性強、低免疫原性、無倫理約束等優勢，使其成為再生醫學領域的研究熱點[2]，是臨床上進行組織修復最理想的細胞選擇，已有報道利用hAMSCs修復皮膚創傷，能夠降低炎性反應，加速創傷愈合，同時減少瘢痕形成[3]。

hAMSCs大量培養擴增是其臨床應用的前提條件。細胞培養環境是影響細胞增殖狀態及臨床應用效果的重要因素[4-5]，體外細胞培養最常使用胎牛血清，而胎牛血清中含有大量未知的成分包括生長因子，免疫活性物質，等等，易引起免疫反應，具有一定的臨床應用風險。因此，hAMSCs培養條件的安全性和標準化問題亟待解決[6-7]。本研究旨在建立一種hAMSCs的無動物源性成分培養方法，為其臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人羊膜組織(中國醫科大學附屬盛京醫院產科)，該研究經中國醫科大學倫理委員會批準(倫理審批號：AF-SOP-07-1.0-01)，并且已經過患者知情同意。胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培養基(Hyclone公司)；兩性霉素B、膠原酶、抗壞血酸(L-ascorbic acid)(Sigma-Aldrich公司)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(Peprotech公司)；胰島素(1 g/L)-轉鐵蛋白(0.55 g/L)-亞硒酸鈉(0.000 67 g/L)(insulin-transferrin-selenium，ITS)和胰蛋白酶(Gibco公司)；抗-CD90、-CD73、-CD34和-CD45抗體(Biolegend公司)，WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(WST-1 Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit，上海碧云天生物公司)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 hAMSCs的分離培養：取健康剖宮產羊膜，用冷0.9%氯化鈉溶液清洗血跡，去除絨毛膜后剪切，取面積大小約25 cm2羊膜，置于含100 U/mL青鏈霉素及2.5 μg/mL兩性霉素B的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)中浸泡20 min。取出剪碎后加入0.25%的胰蛋白酶，于37 ℃消化30 min；終止消化后清洗，1 mg/mL的Ⅳ型膠原酶37 ℃消化1 h；終止消化后細胞篩過濾，加入含有10% FBS，10 ng/mL bFGF，10 ng/mL EGF，100 U/mL青鏈霉素 及 2.5 μg/mL兩性霉素B的 DMEM/F12培養基中[7]，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養條件下常規培養。接種后24 h進行換液，倒置顯微鏡下觀察細胞，達80%匯合時消化傳代，加入DMEM/F12(含 1×ITS、0.5%人血清白蛋白、10 ng/mL bFGF、100 μg/mL L-ascorbic acid、100 U/mL青鏈霉素及2.5 μg/mL兩性霉素B)的培養基中繼續培養。

1.2.2 免疫熒光法檢測鑒定hAMSCs：將處理好的蓋片置入6孔板內，按2 × 105個/mL將ITS無血清培養的hAMSCs接種于蓋片上。當hAMSCs達到70%～80%匯合時，利用4%多聚甲醛室溫固定15 min，1 × PBS 洗滌后1% 牛血清白蛋白室溫封閉30 min，一抗 (抗-CD90、-CD73、-CD34或-CD45抗體)孵育4 ℃ 過夜，1×PBS洗滌后二抗室溫孵育1 h，DAPI染色，95%甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 WST-1檢測細胞增殖：將ITS無血清培養的hAMSCs胰蛋白酶消化后制備成單細胞懸液，以2 000個/孔濃度接種于96孔培養板中，第2天開始每天于同一時間點進行檢測，檢測方法：棄去培養液，PBS洗后更換新鮮培養液100 μL，然后每孔加入10 μL的WST-1，并在37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中孵育1～3 h；取出細胞后，選擇450 nm波長讀取吸光度(A)值。然后以細胞的培養時間為橫坐標，以450 nm波長吸光度值為縱坐標繪制連續檢測7 d后的細胞增殖曲線。

1.2.4 細胞劃痕傷口閉合試驗：當6孔板接種的ITS無血清培養的hAMSCs達90%匯合時，用200 μL槍頭垂直于細胞單層上劃十字形劃痕，力度以剛好能劃落細胞而不在培養板上留下劃痕為標準。PBS清洗后加入ITS培養液，于48 h后觀察劃痕的愈合情況。

1.2.5 RT-qPCR檢測生長因子的表達：ITS培養液培養的hAMSCs達到90%匯合后按照Trizol的試劑說明書提取總RNA，NanoDrop2000超微量分光光度計檢測RNA的A值及比值，以確定RNA的濃度及純度。再按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒說明書將其反轉錄成cDNA。最后按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑說明書混樣，在ABI7500儀器上進行實時定量PCR，PCR反應體系為25 μL，PCR反應條件為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。以GAPDH的表達量作為內參，計算目的基因的表達量，計算方法為2-ΔΔCt相對定量法。PCR引物見表1。

表1 實時定量PCR引物Table 1 Primers for qPCR

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 形態學特征

原代分離培養的hAMSCs，加入ITS培養基，接種3 d后呈現短梭形，7 d后開始伸展，呈魚群樣排列，接種10 d達到 90% 匯合(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察無血清培養的hAMSCsFig 1 Observtion of hAMSCs culturing in serum free medium by inverted microscope(×40)

2.2 免疫熒光鑒定

免疫熒光可見大部分 hAMSCs 表達 CD90 和 CD73，不表達 CD45和CD34(圖2)。

圖2 免疫熒光實驗檢測無血清培養的hAMSCs細胞表面CD34、CD45、CD73和CD90的表達Fig 2 Immunofluorescence assay was used to detect the expression of CD34,CD45,CD73 and CD90 on the surface of hAMSCs cultured in serum free medium

2.3 細胞增殖曲線

繪制ITS無血清培養的P3-P6的hAMSCs細胞增殖曲線(圖3)。第1～2天，細胞增殖速度緩慢，接種后培養第3～4 天處于細胞的快速增殖期，接種后培養第5天進入增殖平臺期。

圖3 hAMSCs細胞增殖曲線Fig 3 Cell growth curves of hAMSCs

2.4 細胞劃痕傷口閉合試驗

ITS培養液培養48 h后，與FBS培養條件下相比，hAMSCs的遷移能力增強，遷移速度加快(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with FBS group圖4 ITS無血清培養基培養的hAMSCs遷移能力增強Fig 4 hAMSCs cultured in ITS serum free medium had a significant increase in cell migration ability compared with

2.5 生長因子的表達

VEGF、KGF、PDGF和IGF-1與FBS對照組相比，ITS組生長因子表達上調(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with FBS group圖5 RT-qPCR檢測ITS無血清培養基培養的hAMSCs生長因子的表達Fig 5 RT-qPCR assay was used to detect the expression of growth factors of hAMSCs cultured in ITS serum-free medium compared with FBS

3 討論

干細胞治療是目前科學研究的熱點，具有很大的臨床應用潛能。但同時也涉及一些實際問題，如安全性，倫理道德問題，因而其應用受到限制。羊膜間充質干細胞的臨床應用具有很多優勢[8]，羊膜的供給不受限制且與脂肪和骨髓相比獲取更便利。羊膜來源細胞的增殖和分化潛能超過脂肪組織，比其他母體來源的細胞分化能力更強。而且胎兒來源的細胞能排除成體來源細胞因年齡引起的增殖分化能力下降的問題。根據需要羊膜間充質干細胞可以于胎兒出生后，分離并儲存，以備將來需要自體移植時可以立刻提供。本實驗研究，通過胰蛋白酶和膠原酶消化分離培養的hAMSCs，細胞得率高，增殖能力較強，P3代以后的細胞形態均一，呈典型的長梭形，魚群樣排列，表達間充質干細胞細胞表面標志物CD73和CD90，不表達CD34和CD45。

細胞為基礎的再生治療需要將細胞在體外培養之后移植到靶組織。隨著越來越多的細胞治療課題從實驗室階段發展到臨床前或臨床階段，無異種蛋白的培養系統對于hAMSCs體外培養越來越重要。這種培養體系的重要性在于能避免免疫排斥，跨種系感染的風險以及對細胞功能的改變，避免與非人源細胞培養成分有關的基因表達。ITS混合成的混合物已經用于很多類細胞的增殖和分化，業已證實，胰島素的促有絲分裂和代謝作用，并且胰島素對于葡萄糖轉運也是至關重要的。轉鐵蛋白是鐵的載體，有助于降低非蛋白結合鐵產生的氧毒性。硒是一種微量元素，通過其在硒蛋白中的結合形式(谷胱甘肽過氧化物酶，硫氧還蛋白還原酶及硒蛋白)而作為培養基中的抗氧化劑[6-7]。本研究利用ITS結合人血清白蛋白對hAMSCs進行大量培養擴增，通過觀察ITS培養條件下hAMSCs增殖和遷移能力，以及生長因子的表達，評估其作為無血清培養添加劑的臨床應用潛能[9-10]。結果證明，ITS培養環境不改變hAMSCs的表型，能夠維持hAMSCs的增殖和遷移能力及生長因子的表達，可以作為hAMSCs臨床應用前的無血清培養基。