不同外源物質對三種柴胡種胚發育的影響

劉計權，王 宇，劉 昕，劉佳寧，王永輝*

(1. 山西中醫藥大學，山西 榆次 030619； 2. 北京中醫藥大學，北京 102488)

傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(Bupleurum)植物約有150種，我國分布有42 種、17 變種、7 變型[1]。2020版《中國藥典》規定，中藥柴胡來源于藥用植物柴胡(BupleurumchinensisDC.)或狹葉柴胡(B.scorzonerifoliumWilld.)的根，按性狀不同，分別習稱“北柴胡”和“南柴胡”[2]。藥用植物黑柴胡(B.smithiiWolff)的根在華北、西北地區作柴胡藥用，被收載于山西、甘肅等地方中藥材標準中[3-5]。

野生柴胡主要分布于華北、東北、西北、山東等地，由于柴胡野生資源蘊藏量非常有限，目前商品柴胡主要來源于人工栽培。20世紀90年代初，山西、陜西、甘肅和河北等地開始人工種植柴胡。在柴胡規范化栽培中以種子進行繁殖，所以種子質量是影響柴胡產量和品質的重要因素。由于柴胡種子具有胚后熟的特性，新收獲柴胡種子的種胚體積僅占胚腔的5.1%，尚處于休眠狀態，需經過形態后熟過程才能發芽。而且柴胡種子極小，千粒重只有1 g左右，常溫下貯藏的種子壽命不超過1年。這些因素導致柴胡播種后發芽率和出苗率極低、出苗不整齊現象，嚴重影響到柴胡栽培中的產量和質量[6]。

通過GA3、肌醇、煙酸三種不同外源物質處理三種柴胡種子，研究其對柴胡種胚發育的影響，以期加速柴胡種胚的發育、縮短后熟期、提高種子的發芽率，服務于柴胡的規范化種植。

1 材 料

供試種子：柴胡(B.chinensis)種子采自山西省絳縣規范化種植基地2年生植株，狹葉柴胡(B.scorzonerifolium)種子采自山西省朔州市平魯區野生植株，黑柴胡(B.smithii)種子采自山西省寧武縣野生植株。2019年新采集的3種柴胡種子均經過鑒定，保存于4℃冰箱備用。

試劑：GA3(北京索萊寶科技有限公司)、肌醇(上海信裕生物科技有限公司)、煙酸(上海恒遠生物科技有限公司)、無水乙醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

儀器：FA2014電子天平(北京中儀宇盛科技有限公司)、BA410生物顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)、HZC-250恒溫培養箱(蘇州市培英實驗設備有限公司)、4號不銹鋼手術刀柄(潮安縣彩塘世紀順興發醫療器械)、22號手術刀片(揚州源康醫療器械有限公司)、5 cm×2.6 cm不銹鋼雙面刀片(上海吉列有限公司)。

2 方法

2.1 單因素試驗

2.1.1 溶液配制

用電子天平分別稱取GA3、肌醇和煙酸適量，用蒸餾水將其溶解，配制GA3(50、100、150、200、250 mg/L)、肌醇(25、50、75、100、125 mg/L)和煙酸(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L)系列濃度溶液，放置冰箱4℃保存。

2.1.2 供試種子處理

挑選飽滿、大小、色澤一致的優質柴胡種子，用70%酒精溶液消毒30 s，消毒后用蒸餾水反復清洗種子3次，之后分別將種子浸泡在配制好的系列濃度溶液中，室溫下浸泡24 h，蒸餾水做空白對照。

2.1.3 供試種子培養

取直徑12 cm的干凈培養皿，每個培養皿底部墊2層吸水紙，加入5 mL蒸餾水浸潤吸水紙。將上述浸泡處理的柴胡種子均勻擺放至培養皿，每個培養皿擺放100粒種子，蓋上蓋子置于20℃培養箱進行無光培養，每處理重復4次。

在供試種子培養期間，每天查看培養皿中供試種子的情況，如有發霉種子及時進行清洗并更換吸水紙，每天中午定時添加1 mL蒸餾水以保持濕度。

2.1.4 種子胚率和發芽率測定

上述種子培養第20天測定種子胚率和發芽率。從每個培養皿中隨機抽取10枚種子，從種子中間縱切、制片，在顯微鏡下測定種子的胚長、胚乳長，并計算胚率(胚率=胚長/胚乳長×100%)；培養結束后記錄發芽種子數，并計算發芽率。

2.2 正交優化試驗

通過單因素實驗得到GA3、肌醇和煙酸浸種后促進柴胡種胚發育的最適宜濃度，在此基礎上選用L9(34)正交表，以GA3(A)、肌醇(B)、煙酸(C)作為考察因素，按照體積比為1∶1∶1進行組合，對柴胡種子浸泡處理。以種子的胚率為指標，進行最佳組合考察，每個因素設3個水平。

3 結果

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 GA3處理對柴胡種子胚率的影響

GA3處理對柴胡種子胚率的測定結果見表1。隨著GA3處理濃度的加大，柴胡種子的胚率呈現遞增趨勢，當處理濃度為200 mg/L時，種子胚率達到最大67.44%，當處理濃度為250 mg/L時，種子胚率出現下降。本試驗中GA3為200 mg/L時是最適宜的處理濃度。

表1 GA3對柴胡種子胚率的影響Table 1 Effects of GA3 on embryo rates of B. chinensis seeds

3.1.2 肌醇處理對柴胡種子胚率的影響

肌醇處理對柴胡種子胚率的測定結果見表2。肌醇系列濃度處理柴胡種子后，種子胚率出現先增加后下降的趨勢，其中本試驗中處理濃度為75 mg/L時為最適宜濃度，種子胚率達到最大46.01%。

表2 肌醇對柴胡種子胚率的影響Table 2 Effects of inositol on embryo rate of B. chinensis seeds

3.1.3 煙酸處理對柴胡種子胚率的影響

煙酸處理對柴胡種子胚率的測定結果見表3。煙酸不同濃度對柴胡種胚發育有一定的促進作用，當煙酸濃度達到2.0 mg/L時，種子胚率達到最大48.17%，之后隨著濃度增加種子胚率出現下降。本試驗中煙酸濃度為2.0 mg/L時是最適宜濃度。

表3 煙酸對柴胡種子胚率的影響Table 3 Effects of nicotinic acid on embryo rate of B. chinensis seeds

3.2 正交試驗結果

選用L9(34)正交表進行最佳組合考察，以GA3(A)、肌醇(B)、煙酸(C)作為考察因素，每個因素設3個水平，各因素水平表見表4。

表4 因素水平表Table 4 Factor level table

三種外源物質組合的正交試驗結果見表5。由表中數值進行直觀分析可以看出，各因素對柴胡種子胚率影響作用由大到小依次為GA3濃度>煙酸濃度>肌醇濃度，初步確定最佳的濃度組合為A2B3C3，即GA3濃度為200 mg/L、肌醇濃度為90 mg/L、煙酸濃度為2.25 mg/L。

表5 正交試驗結果Table 5 Results of orthogonal test

為進一步明確各因素水平變化對試驗結果是否具有顯著影響，進行方差分析。表6方差分析結果顯示，因素A和C的水平變化對試驗結果有顯著影響，故因素A和C確定為3水平；因素B對試驗結果無顯著影響，確定因素B為1水平。因此確定處理柴胡種子最佳濃度組合為A3B1D3，即GA3濃度為225 mg/L、肌醇濃度為60 mg/L、煙酸濃度為2.25 mg/L。

表6 正交試驗方差分析表Table 6 Analysis of variance for orthogonal test

4 結果驗證

為了驗證最優濃度組合，采用正交試驗優選出的最佳因素水平A3B1C3。按上述方法處理三種柴胡種子，以蒸餾水做對照，重復3次。三種柴胡種子胚率、發芽率測定結果見表7。與對照相比，GA3、肌醇、煙酸三種外源物質最優濃度組合能夠明顯促進三種柴胡種胚的發育，提高種子的發芽率，說明該結果用于柴胡種子的處理具有可行性。三種外源物質最優濃度組合對柴胡(B.chinensis)種胚的促進作用最大，對狹葉柴胡(B.scorzonerifolium)種胚的促進作用次之，對黑柴胡(B.smithii)種胚的促進作用最小，這可能與三種柴胡的生物學特性、種子來源不同有關。

表7 胚率和發芽率測定結果Table 7 Results of determination of embryo rate and germination rate

5 討 論

柴胡種胚的發育先后要經過原胚、棒狀胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和雙子葉胚等幾個階段[7]。自然成熟期采收的柴胡種子的胚處于不同發育階段，經石蠟切片研究發現，約20%左右的種胚處于球形胚，70%左右的種胚處于心形胚，10%左右的種胚發育到魚雷胚，沒有發現處于雙子葉胚階段的種胚[8]。自然成熟期的柴胡種胚存在嚴重的形態后熟現象，所以即使給予適宜的發芽條件也不可能萌發。

柴胡種子胚率是種子質量的重要指標，當種胚發育到一定階段才具備發芽的能力。研究報道，當柴胡種子的胚長達到胚乳長的60%～70%時才能萌發[9]。新采收的柴胡種子常溫存放5個月后種子胚率只能達到16.69%；當年生柴胡種子自然狀態下存放到下一年春季播種，發芽率僅為30%～40%[10]。因此，生產上為提高柴胡種子發芽率和出苗率，一般需要對新采集的柴胡種子進行播種前處理。在土壤中層積處理能加速柴胡種胚的發育，促進種胚后熟，層積處理5個月，發芽率可達到50%～60%[6]。

GA3能夠促進已分化芽的伸長生長；肌醇參與植物碳水化合物代謝，對組織快速生長有促進作用，對胚狀體和芽的形成有良好影響；煙酸對植物的代謝過程和胚的發育有一定的促進作用[11]。本文研究結果可用于柴胡規范化種植中的種子處理，提高種子發芽率、出苗率和出苗整齊度。關于GA3、肌醇、煙酸三種外源物質組合對柴胡后期種苗生長、藥材產量和品質形成的影響有待于進一步研究。