乳腺癌鈣化與基因表達譜及臨床特征的相關性研究

邵華，馮傳波，王鐘林，朱雙九，鄭新聞

（連云港市第二人民醫院 甲乳外科，江蘇 連云港）

0 引言

乳腺鉬靶X線是乳腺癌的主要影像學檢查方法，在術前篩查、腫瘤分期、療效評估、監測復發等方面發揮重要作用[1]。鈣化是鉬靶X線檢查中一個比較常見的現象，約有40%~50%的乳腺癌可呈現鉬靶X線鈣化[2]。近年來，放射基因組學在乳腺癌的應用成為一個熱點，放射基因組學可以對乳腺癌病變特征進行量化，以便更好地區分良惡性病變和患者特征，從而實現更精確的成像和篩查，以指導針對性的治療[3]。本文通過對乳腺癌患者手術新鮮標本進行全基因組測序，分析乳腺癌鉬靶X線鈣化與臨床特征及基因表達譜之間的關系，以期將鈣化檢查與腫瘤的生物學行為相結合，間接提示腫瘤分子生物學行為，為乳腺癌患者治療提供有效指導，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年12月至2019年12月我院收治的經病理確診的乳腺癌患者100例，均為女性；年齡29~76歲，平均（53.01±13.33）歲。其中TNM分期Ⅰ期10例，Ⅱ期31例，Ⅲ期59例，其他臨床資料詳見表1。入組標準：（1）術前未經過化療；（2）無遠處轉移；（3）有明確病理；（4）有術前乳腺鉬靶X線檢查及完整的臨床資料。排除標準：（1）非侵襲性乳腺癌；（2）早期接受新輔助化療者；（3）伴有除乳腺癌外其他惡性腫瘤；（4）伴隨其他臟器的鈣化。本研究經我院倫理委員會同意，所有患者或委托人均簽署知情同意書。

1.2 術前乳腺鉬靶X線檢查

患者常規于術前行乳腺鉬靶X線檢查，采用Senographe 2000D全自動化乳腺攝影機行側斜位（MLO）及軸位（CC）攝影。按照乳房影像報告和數據系統（BI-RADS分級）標準對患者的乳房X線影像特征進行評估，由兩位醫師獨立評估患者級別并針對每個病例填寫BI-RADS分類表：1：正常；2：良性；3：可能是良性；4A：低度可疑；4B：中度可疑；4C：高度可疑；5：高度提示為惡性病變。將患者分為3組，1和2作為無可疑鈣化組，3、4A和4B作為疑似惡性鈣化組，4C和5作為高度疑似惡性鈣化組（分別簡稱為無可疑組、疑似組及惡性組）。

1.3 構建患者基因表達譜

術中收集患者的新鮮病理組織，用Trizol法提取總RNA，反轉錄為cDNA后，進行文庫建庫，并采用二代測序技術，檢測全基因組表達譜。采用R語言軟件包分析測序結果，對比3組檢測結果中基因表達的差異，篩選出差異顯著的基因（P<0.05），確定哪些差異基因可能與乳腺癌鈣化形成相關，并篩選出相關性最大的靶基因。

1.4 統計學方法

應用SPSS 23.0做相關統計處理，三組患者臨床特征之間差異的比較用行X列表χ2檢驗，計量資料用（±s）表示，三組中ER、PR、Ki67以及Her-2基因表達的差異，用各樣本測序歸一化后再進行log2計算得出的信號值作為數值，分別進行各組的兩兩比較，采用完全隨機設計兩均數比較t檢驗，P<0.05作為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同種類鈣化與乳腺癌臨床病理特征之間的關系

100例乳腺癌患者經術前乳腺鉬靶X線檢查及鈣化評估，具體分組為：無可疑組32例，疑似組35例，惡性組33例。對三組患者的臨床病理特征如年齡、絕經情況、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移以及TNM分期進行比較，結果見表1。從表1可以看到，在年齡、絕經情況、腫瘤大小、組織學分級以及TNM分期等指標上，三組間沒有顯著性差異。而在淋巴結轉移病例與無淋巴結轉移病例之間，三組有顯著性差異。這反映出鈣化與淋巴結轉移可能具有一定的內在聯系。

表1 鈣化與乳腺癌臨床病理特征之間的關系[n(%)]

2.2 三組中ER、PR、Ki67以及Her-2基因表達的相互比較

鑒于ER、PR、Ki67以及Her-2在乳腺癌分子分型中的重要性，我們從基因表達譜中，利用上述基因特異性探針檢測各樣本，歸一化后再進行log2計算得出信號值。將各基因的三組數值進行兩兩比較，結果如下：ER、PR、Ki67的表達在三組中均無顯著性差異，而Her-2的表達在無可疑組及疑似組中無顯著性差異，但無可疑組與惡性組、惡性組與疑似組相比，差異均有統計學意義（P<0.05），具體見表2。

2.3 三組中基因組表達差異分析

我們將三組的基因組組成進行差異基因分析，共發現2462個基因在P<0.05的水平上有差異表達。其中，無可疑組與惡性組比較，共有差異基因1763個（上調912個，下調851個）；疑似組與惡性組比較，共有差異基因354信（上調216個，下調138個）；疑似組與惡性組比較，共有差異基因398信（上調242個，下調156個）。進一步分析無可疑組與惡性組差異基因，將兩者差異基因按P值大小或差異倍數（Fold change）大小，選取排名前10基因，見表3和表4。從結果可以看出，在表3和表4中同時出現的僅有Her-2基因，且排名均靠前。提示Her-2基因在鈣化分組中差異明顯，這與表2結果一致。

表2 三組中ER、PR、Ki67以及Her-2基因表達的相互比較（±s）

表2 三組中ER、PR、Ki67以及Her-2基因表達的相互比較（±s）

項目 無可疑組vs疑似組 無可疑組vs惡性組 疑似組vs鈣化組ER 7.36±0.91vs7.75±0.94（P=0.095）7.36±0.91vs7.45±0.92（P=0.710）7.75±0.94vs7.45±0.92（P=0.189）PR 15.67±0.95vs15.30±1.03（P=0.135）15.67±0.95vs15.88±1.64（P=0.533）15.30±1.03vs 15.88±1.64（P=0.091）Ki67 3.97±1.19vs4.18±0.70（P=0.360）3.97±1.19vs4.00±0.62（P=0.874）4.18±0.70vs 4.00±0.62（P=0.265）Her-2 10.46±0.96vs 10.58±0.58（P=0.532）10.46±0.96vs11.76±0.99（P<0.05）10.58±0.58vs 11.76±0.99（P<0.05）

表3 按P值篩選的差異基因表達前10位基因

表4 按差異倍數篩選的差異基因表達前10位基因

3 討論

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，美國腫瘤協會于2017年1月發布的數據顯示乳腺癌十幾年來一直是女性惡性腫瘤中發病率最高的疾病[4]。鈣化是乳腺癌常見的影像學表現，有時甚至是臨床乳腺癌檢查能發現的唯一征象[5]；此外，鈣化的檢測和表型特征對乳腺癌患者術前評估病變范圍和術后治療效果檢測具有重要提示作用[6]。在我們的研究中，利用患者基因表達譜分析鈣化與基因表達之間的關系，我們發現Her-2在高度疑似鈣化組中的表達較無疑似鈣化組明顯上調，揭示鈣化有可能反映乳腺癌患者更具侵襲性。

一直以來，不斷有研究試圖闡明鈣化的本質及其反映的分子生物學特性的內在含義。乳腺癌在發生發展過程中一種或多種相關基因的異常表達有重要作用，這些異常表達的基因可引起人體組織相對應的病理改變，從而反映出外在的諸如鈣化等的影像學特征。因此乳腺癌的分子生物學、組織病理學及影像學特征間存在著一定的聯系，隨著放射基因組學的進步，根據影像學特征在分子水平闡述腫瘤組織病理學特征成為可能[7]。已有一些研究分析乳腺鉬靶X線鈣化分型與腫瘤組織學分型或分子標志物，如ER、PR和Her-2等之間的相關性，通過免疫組織化學結果分析顯示，乳腺鉬靶X線鈣化常與侵襲性乳腺導管內原位癌（Ductal Carcinoma in Situ, DCIS）或Her-2陽性乳腺癌具有相關性[8-9]。但這些研究均基于免疫組化結果，于蛋白表達層面進行分析，缺乏對基因變化的深入分析。

隨著二代測序技術的發展成熟，對不同病理分期特征的組織全基因組學檢測成為研究熱點。Ahmed等[10]分析了56名雌激素受體陽性乳腺癌患者的磁共振影像與基因表達譜之間的關系，提示乳腺癌磁共振顯像有四種影像學表型，且與基因表達譜檢測的復發可能性相關。篩選出的成像生物標志物有助于指導治療決策。Lehmann和Prat等[11-12]應用基因表達譜對三陰性乳腺癌鑒定不同的分子特征，從而確定了相關亞群，對指導三陰性乳腺癌的治療幫助巨大。目前，對有關鈣化的分子生物學仍知之甚少，且對不同乳腺癌鉬靶X線成像的全基因轉錄組學特征分析尚缺乏系統研究。我們的研究利用二代測序技術，提示乳腺癌的基因表達模式在有鈣化或無鈣化的患者之間有顯著不同。高度可疑鈣化的乳腺癌與HER-2基因表達密切相關。同時，我們發現鈣化與乳腺癌淋巴結轉移亦密切相關。研究發現激活的HER-2基因通過促進分泌細胞基底膜降解酶、改變整合素和黏合素的功能、激活MAPK等多條途徑，逃避微環境的監控，增強轉移潛力。因此，Her-2陽性表明腫瘤容易侵襲擴散[13]。因此，與無鈣化乳腺癌患者相比，鈣化型乳腺癌可能具有較高的侵襲性和轉移性。根據鈣化預測乳腺癌的生物學行為可能有重要的臨床意義。

誠然，我們的研究也存在一些局限性。首先，入組本研究的病例樣本數較少。乳腺癌是一種異質性很強的惡性腫瘤，這就導致病例樣本間基因表達譜有可能存在很大不同。我們的數據顯示HER-2在鈣化患者中表達上調，尚缺乏多中心或更大樣本范圍的驗證。其次，對于基因譜中除了HER-2之外，排名靠前的其他基因在乳腺癌鈣化中的作用，我們沒有進一步討論，有待于在今后的體內體外實驗研究中深入分析。

綜上所述，本研究根據患者乳腺鉬靶X線鈣化影像學特征進行分組，構建不同分級患者基因表達譜，為進一步闡述乳腺癌放射基因組學研究提供臨床數據。研究證實，淋巴結轉移病例與無淋巴結轉移病例之間、Her-2表達上，無鈣化及有高度疑似惡性鈣化的患者間有顯著性差異。有無鈣化組間共有2462個基因表達差異。Her-2基因在高度疑似惡性鈣化的乳腺癌中表達上調（4.833倍，P<0.05）。說明乳腺癌中的鈣化與Her-2的mRNA過表達和淋巴結轉移密切相關。這一結果有助于進一步理解乳腺癌的生物學特征，為乳腺癌的臨床治療提供指導。