一種新型載液細胞培養和觀察裝置的設計及其應用

鐘 正， 阮亦銘， 俞大良， 侯 森，2

（1.暨南大學環境學院，廣州511486；2.中國科學院南京土壤研究所，土壤環境與污染修復重點實驗室，南京210008）

0 引 言

激光共聚焦顯微鏡［1］經過幾十年的改進已成為科學研究的重要工具［2］，在生物學、環境學、測量學、醫學、材料學中占據了重要地位。由于其卓越的光學層掃和三維構建能力［3］，激光共聚焦顯微鏡廣泛運用于組織和細胞中的分子和結構的檢測、細胞內離子濃度變化的測量、熒光相關數據的測量、長時間細胞遷移和生長的觀測、三維表面的測量等生物學研究領域中［4-7］。與普通熒光顯微鏡相比，激光共聚焦顯微鏡的激發光通過針孔而排除了次級熒光干擾，形成更加清晰的圖像［8］。激光共聚焦顯微鏡可同時對多種熒光染料標記的樣本進行信息獲取和構建，同時進行局部的光操作［9］。激光共聚焦顯微鏡要求使用厚度極薄的玻璃片（通常厚度為0.13～0.16 mm）作為樣品載物裝置［10］。而目前常用的載物裝置在使用成本、細胞培養可行性、反復滅菌能力等諸多方面還存在著種種缺陷，無法滿足細胞培養觀測的使用要求。

激光共聚焦顯微鏡是在傳統光學顯微鏡的基礎上加裝激光掃描裝置，利用針孔阻斷焦距外的光線以排除探測器聚焦外的光線，再利用光柵式掃描進行成像的顯微鏡［11］。激光共聚焦顯微鏡采用共軛聚焦的方式，逐點掃描觀測樣品，從而實現了對熒光標記樣品的高分辨三維成像［12］。激光共聚焦顯微鏡物鏡的最前端與聚焦平面的距離（即工作距離）較短［13］，通常需要使用厚度不超過0.17 mm的玻片承載被測物進行實驗［14-15］。為了適應這一要求，人們通常采用0.13～0.16 mm的蓋玻片來承載被觀測物。在觀測細胞時，通常做法是首先取細胞懸液滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，此時細胞位于載玻片和蓋玻片之間的狹小空間內；之后將整個載玻片與蓋玻片的組合翻轉，使得原本處于上方的蓋玻片翻到下方，載玻片和蓋玻片之間通過細胞懸液的表面張力結合在一起；最后將載玻片與蓋玻片的翻轉組合置于物鏡上方進行觀測。這種方法的局限性在于載玻片和蓋玻片之間的空間無法密閉，因此難以防止染菌、防塵及防止液體蒸發；此裝置加載的液體量有限，無法達到長時間的培養細胞要求；在翻轉過程中會導致觀測物的攪動及玻片之間的液體溢出從而影響觀測結果。另外一種承載器件設計方案是將0.17 mm蓋玻片用特殊生物膠粘合在帶孔的圓柱形塑料培養皿底部，制成一次性商業化的真核細胞培養載液裝置，細胞在底部玻片和帶孔培養皿構成的空間內生長。實驗時可將此裝置直接置于物鏡上方進行觀測不用翻轉。但是這種商業化的器件底部的玻片已經粘合固定，無法對玻片拆下進一步修飾；且器件為不耐高溫的塑料制成，不能承受反復高溫滅菌，只能一次性使用；器件價格昂貴，使用一次大約花費10元人民幣；且需要特殊的支架才能固定于載物臺上，并不一定兼容普遍使用的載玻片支架。若能針對目前激光共聚焦顯微鏡常用觀測器件的短板，制備一種能反復滅菌且拆卸方便、價格低廉的、方便固定于載物臺操作的面向真核細胞培養的激光共聚焦顯微鏡載液器件，將會對激光共聚焦顯微鏡及其相關儀器（如激光共聚焦熒光相關譜儀）的推廣，產生極大的推動作用。

本文在以往觀察裝置的基礎上，結合激光共聚焦顯微鏡的特點，針對細胞培養和重復使用等特性進行研究，設計了一種新型真核細胞培養的載液裝置。該載液裝置的尺寸按照普通載玻片設計，能夠直接適用于各類載玻片支架；并且其成本低廉、可拆裝、可重復滅菌使用、使用操作方便。對這種新型載液細胞培養器件進行了制片、滅菌、細胞培養、成像等實驗。結果證明，本裝置可為激光共聚焦顯微鏡提供一種可進行真核細胞培養的、能夠用于常用的載玻片載物臺的、成本低廉的、可重復使用的新型載液器件。

1 材料和方法

1.1 新型載液觀察裝置

新型載液觀察裝置由下載器、載物玻片、密封墊、上載器、分離式上蓋、固定螺絲組成。裝置中厚度為1 mm的下載器、厚度為10 mm的上載器均采用玻璃材質；厚度為0.1 mm的密封墊采用硅膠材質；載物玻片使用面積為24 mm×50 mm，厚度為0.13～0.16 mm

的蓋玻片，分離式上蓋采用面積為24 mm×75 mm，厚度為1～1.2 mm的載玻片。下載器兩側設有兩個對稱的圓孔，中間設有較大的圓孔，沿下載器長度中線將下載器分為對稱的兩塊，下載器上方蓋有載物玻片。載物玻片上方蓋有密封墊，密封墊兩側設有兩個對稱的圓孔，中間設有較大圓孔。密封墊上方蓋有上載器，上載器中間設有較大圓孔，兩側設有兩個對稱的圓孔，兩個對稱圓孔上方內側設有螺紋，螺紋與螺絲配套用于固定組件。接入細胞后，在上載器上方覆蓋分離式上蓋防止染菌。細胞在載物玻片、密封墊、上載器、分離式上蓋組成的密閉空間內培養。

1.2 細胞培養

將HeLa人宮頸癌細胞培養于90%DMEM高糖培養基中（ThermoFisher，中國上海英濰捷基貿易有限公司），培養基中添加10%的胎牛血清（Hyclone/?？寺?，中國廣州研信生物科技有限公司），1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液（Gibco，中國廣州研信生物科技有限公司）；細胞培養溫度為37℃，含有5%CO2。實驗時，首先用磷酸鹽緩沖液（PBS，aladdin/阿拉丁，中國上海阿拉丁生化科技股份有限公司）沖洗細胞，然后加入0.25%胰蛋白酶（0.25 g胰蛋白酶，100 mL PBS（1X），源葉生物，中國上海源葉生物科技有限公司），在37℃、5%CO2的加濕培養箱中培養3 min，再加入DMEM培養基并將細胞從壁上輕輕吹脫，離心去上清液后重新加入DMEM培養基，制成細胞懸液。將細胞懸液加入已消毒的新型載液觀察裝置中培養。

1.3 細胞染色和成像

培養細胞接種于載液觀察裝置，培養12、24、36 h后使用普通顯微鏡（EVOS?FLoid，美國Thermo Fisher Scientific）進行觀測。藍色熒光染料Hoechst 33342能夠穿透細胞膜對細胞核進行特異性染色。碘化丙啶（PI）是一種紅色熒光的細胞核染色試劑，特異性染色死亡細胞。將細胞接入本裝置培養16 h后，移去培養基，加入PBS緩沖液沖洗，然后加入1 mL稀釋100倍的雙氧水并孵育20 min，加入PBS緩沖液沖洗，再加入含有染色液的培養基孵育20 min，含染色液的培養基為10μL Hoechst33342試劑（1 mg/mL，Solarbio/索萊寶，中國北京索萊寶科技有限公司）與10μL碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）試劑（1 mg/mL，Solarbio/索萊寶，中國北京索萊寶科技有限公司）混勻于1 mL的培養基制備而成，最后使用熒光顯微鏡（EVOS?FLoid，美國Thermo Fisher Scientific）對染色完成的細胞進行觀測。將細胞接入本裝置培養12 h后，使用Hoechst33342和PI染色劑對細胞進行染色，然后使用激光共聚焦顯微鏡（LMS900，德國Zeiss）進行觀測。

1.4 滅菌實驗

使用滅菌鍋（GI36DP，中國廈門至微儀器有限公司）對裝置進行滅菌，在溫度123℃、氣壓0.1 MPa情況下滅菌30 min，觀察滅菌前后器件形貌的變化。

2 結果與討論

2.1 新型載液觀察裝置結構

新型載液觀察裝置的構造如圖1所示，其上載器、下載器采用玻璃制成，在使用過程中不易出現彎曲、變形。密封墊采用硅膠制成，載物玻片上覆蓋的密封墊對載玻片和上載器進行貼合密封，可避免液體外泄。載物玻片可用普通蓋玻片（0.13～0.16 mm厚度）代替，既可以一次性使用，也可以反復清洗滅菌使用。裝置組裝時，按照從下到上的順序將下載器、載物玻片、密封墊、上載器組合，然后使用兩顆固定螺絲從下載玻片兩側的圓孔擰入，將組件進行固定。細胞在由載物玻片、密封墊、上載器和分離式上蓋構成的圓柱形密閉空間培養。該空間可容納3 mL細胞培養液。采用硅膠密封墊對載物玻片和上載器進行貼合密封進而有效防止漏液。在上載器上方覆蓋分離式上蓋以防止液體蒸發、落塵、染菌，使得本裝置具有了長時間培養細胞的可行性。

圖1 新型載液觀察裝置結構圖（mm）

為了保護構造脆弱的載物玻片，在載物玻片的下方增加厚度為2 mm的玻璃制分離式下載器來支撐整個裝置，可以減少由于受力不均而造成載物玻片碎裂的風險。同時在載物玻片與上載器之間使用硅膠密封墊，緩沖載物玻片與上載器的剛性接觸，使載物玻片始終處于壓力均勻、穩定的狀態，大大降低了載物玻片碎裂的風險。

2.2 細胞培養

探究了新型載液觀察裝置進行長時間細胞培養和細胞觀測的可行性。在接入細胞后的0、12、24、36 h時對其中培養的細胞進行觀測（見圖2）。細胞培養0 h時細胞未完全沉降至載物玻片上，仍有部分細胞懸浮在液體培養基中，此時細胞還未增殖，密度較低，使用顯微鏡可以清晰地看到細胞已貼附于載物玻片上，呈現出大小均一的球形，形貌正常（見圖2（a））；細胞培養12 h后，細胞已經貼壁生長，正常貼壁發育的HeLa細胞呈梭形，圖中細胞外形緊湊、形態分明、輪廓清晰，細胞貼壁生長情況良好（見圖2（b））；細胞培養24 h后細胞繼續增殖，細胞覆蓋率達到60%左右，細胞排列緊密，邊緣整齊，細胞增殖和生長情況良好（見圖2（c））；細胞培養36 h后細胞增殖數量較多，細胞覆蓋率達到85%左右，細胞排列緊密，細胞質均勻，生長情況良好（見圖2（d））。從以上分析可知，細胞可在本裝置中長時間生長，生長狀態正常，無染菌情況，同時表明這種新型載液觀察裝置能夠直接使用普通顯微鏡進行培養細胞的實時觀測。

圖2 細胞在新型載液觀察裝置培養

2.3 激光共聚焦顯微鏡成像實驗

與傳統光學顯微鏡相比，激光共聚焦顯微鏡加裝了激光掃描裝置，逐點掃描熒光標記樣品，最后對各點的信息進行總和，從而實現對樣品的成像。對本裝置內培養的細胞用于激光共聚焦顯微鏡觀測的可行性進行研究。用雙氧水處理器件內培養的細胞并且使用Hoechst 33342和PI進行細胞染色。細胞經Hoechst 33342染色后所有細胞核呈藍色（見圖3（a）），經PI染色后部分細胞核呈紅色（見圖3（b））。染色部分輪廓清晰，說明細胞的藍色和紅色熒光信號可有效通過新型載液觀察裝置被共聚焦顯微鏡觀測到（20×（NA 0.75）物鏡）。從紅藍熒光場合成圖（見圖3（c））可以看出，藍色信號區域與紅色信號區域重合良號。此外使用40倍和63倍油鏡同樣可以達到對雙熒光信號的有效共聚焦顯微鏡觀測（見圖3（d）～（i））。

圖3 染色細胞的激光共聚焦顯微鏡成像圖

20×（NA 0.75）物鏡的工作距離為0.60 mm；40×（NA 1.3）油鏡的工作距離為0.22 mm；63×（NA 1.4）油鏡的工作距離為0.19 mm；100×（NA 1.4）油鏡的工作距離為0.17 mm［16］。本裝置的載物玻片厚度為0.13～0.16 mm，完全能夠滿足物鏡工作距離的要求，使用物鏡或油水浸鏡都能觀測到清晰的圖像。

2.4 熒光顯微鏡成像實驗

使用藍色熒光染料Hoechst33342（1 mg/mL）和紅色熒光染料PI（1 mg/mL）對新型載液觀察裝置內培養16 h的細胞進行染色后，使用普通熒光顯微鏡進行觀測并記錄圖像（見圖4）。Hoechse33342染料可將細胞的細胞核染成藍色，PI染料可將死亡細胞的細胞核染

成紅色。結果表明，使用藍色熒光染料Hoechst33342和紅色熒光染料PI對培養在新型載液觀察裝置中的細胞進行染色后，能夠使用普通熒光顯微鏡對細胞進行觀測，得到清晰的染色細胞藍場、紅場圖像。其中藍色熒光部分為所有細胞核（圖4（b））；紅色熒光部分表示壞死細胞的細胞核（圖4（c））；細胞核位置與明場細胞位置（見圖4（a））呈現出一致性。

圖4 新型載液觀察裝置中培養的細胞經Hoechst和PI染色后的圖像

Hoechst33342作為常用的藍色熒光染料，其最大發射波長為460 nm，PI作為常用的紅色熒光染料，其發射波長為615 nm，由于裝置使用普通蓋玻片作為載物玻片，波長范圍在460～615 nm之間的光亦可通過，因此本裝置適用于多種可見光波段的熒光顯微鏡觀測。

2.5 其他特色

本裝置采用的主要材質為玻璃，可以承受高溫高壓。將裝置進行組合后使用蒸汽滅菌鍋對新型載液觀察裝置進行了滅菌實驗（見圖5）。如圖5（a）所示，滅菌前下載器、載物玻片、密封墊、上載器、分離式上蓋均無損壞、變形情況。由圖5（b）所示，滅菌后下載器、載物玻片、密封墊、上載器、分離式上蓋均無損壞、變形情況，裝置整體無變化。為了驗證新型載液裝置能夠承載細胞懸液不漏液，將培養基加入到該新型載液裝置，由圖5（c）可知，新型載液裝置經滅菌鍋高溫高壓滅菌后加載細胞懸液后，可以完美承載細胞懸液不漏液。

本裝置可重復使用，可以進行批量滅菌，需要進行多次實驗時只需增加裝置數量即可滿足使用需求。本裝置使用的載物玻片單價約為0.05元，價格便宜。其余部分的材料由玻璃或硅膠制成，可以反復使用，每次使用的損耗很小可以忽略不計。與單價為10元左右的一次性商業化的細胞培養皿相比，這種新型載液裝置單次使用的成本約為培養皿的0.5%。

本裝置的一個特色是可以直接裝載于面向普通載玻片的載物臺支架進行觀測（見圖6）。載玻片是最普遍的顯微鏡載物器件，幾乎所有的顯微鏡都設計有能夠裝載載玻片的支架。本裝置的下載器、載物玻片、密封墊、上載器、分離式上蓋到組裝而成的整個裝置都參照載玻片的尺寸設計，為26 mm×76 mm的長方形結構，適應載玻片的載物臺支架。且本裝置總高12 mm，在激光共聚焦顯微鏡載物臺可容納的高度范圍內。這種面向普通支架設計的器件比起目前市場上商業化的圓柱形培養皿，具有更好的普適性。

圖6 新型載液觀察裝置固定于共聚焦顯微鏡載物臺

3 結 語

綜上所述，本裝置價格便宜，安全耐用，能夠反復滅菌，是一種適用于普通顯微鏡支架（如載玻片支架）的面向真核細胞培養的新型激光共聚焦顯微鏡載液器件。將普通蓋玻片經過器件固定即可形成載液細胞培養觀測器件，在各個實驗室可輕松獲得，每次使用僅需替換載物玻片，具有很高的實用性，有望能推廣使用。