糞便SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化檢測在大腸腫瘤篩查中的臨床應用

孟岳?余中貴?黃文峰?許岸高?李丙生

【摘要】目的 評估檢測大腸腫瘤患者糞便中SEPT-9和微RNA（miRNA）-34b/c基因甲基化對大腸腫瘤篩查的臨床性能。方法 采用病例對照研究方法，使用甲基化敏感性高分辨率熔解曲線法檢測大腸腫瘤患者（大腸癌組35例、大腸腺瘤組47例）和正常對照人群（正常對照組52名）糞便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因是否存在甲基化，來評估其篩查大腸腫瘤的性能。結果 大腸癌組SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化陽性率分別為68.6%、71.4%，大腸腺瘤組分別為57.4%、63.8%，正常對照組分別為9.6%、11.5%。3組的SEPT-9、miRNA-34b/c基因甲基化陽性率比較差異均有統計學意義（χ2SEPT-9 = 37.185，χ2miRNA-34b/c = 40.040，P均< 0.001），利用Bonferroni法進行兩兩比較，大腸癌組和大腸腺瘤組的甲基化陽性率比較差異無統計學意義，兩者與正常對照組比較差異均有統計學意義（P均< 0.001）。3組聯合檢測SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化陽性率為88.6%、76.6%、13.5%，大腸癌組和大腸腺瘤組聯合檢測的甲基化陽性率均高于SEPT-9單基因檢測和miRNA-34b/c單基因檢測（P均< 0.05）。結論 檢測糞便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化具有效好的大腸腫瘤篩查性能，或許可作為大規模人群篩查大腸腫瘤新的生物標志物組合;多基因甲基化聯合檢測篩查的性能優于單基因。

【關鍵詞】大腸腫瘤;SEPT-9;miRNA-34b/c;甲基化;甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析

Clinical performance of detecting fecal SEPT-9 and miRNA-34b/c gene methylation for colorectal tumor screening Meng Yue， Yu Zhonggui， Huang Wenfeng， Xu Angao， Li Bingsheng. Departmengt of Gastroenterology， the First Hospital of Huizhou， Huizhou 516000， China

Corresponding author， Li Bingsheng， E-mail： 1102066844@ qq. com

【Abstract】Objective To access the clinical performance of detecting fecal SEPT-9 and miRNA-34b/c gene methylation for colorectal tumor screening in patients diagnosed with colorectal tumor. Methods In this case-control study， the fecal SEPT-9 and miRNA-34b/c gene methylation in patients diagnosed with colorectal cancer（n = 35），colorectal adenoma（n = 47） and normal controls （n = 52） was identified by by using methylation-sensitive high-resolution melting （MS-HRM） to access the clinical performance for colorectal tumor screening. Results The methylation rates of fecal SEPT-9 and miRNA-34b/c detection in the colorectal cancer group were 68.6% and 71.4%， 57.4% and 63.8% in the colorectal adenoma group， and 9.6% and 11.5% in normal control group， respectively. The methylation rates of SEPT-9 and miRNA-34b/c significantly differed among three groups （χ2SEPT-9 = 37.185， χ2miRNA-34b/c = 40.040， all P < 0.001）. According to two-group comparison by using Bonferroni correction，the methylation rates did not significantly differ between the colorectal cancer and colorectal adenoma groups （both P > 0.05）， which significantly differed from those in the normal control group （all P < 0.001）. The methylation rates of combined detection of SEPT-9 and miRNA-34b/c were 88.6% in the colorectal cancer group， 76.6% in the colorectal adenoma group and 13.5% in normal control group. Combined decection methylation rates of SEPT-9 and miRNA-34b in colorectal cancer group and colorectal adenoma group were significantly higher compared with that of either SEPT-9 or miRNA-34b/c alone （all P < 0.05）. Conclusions Detecting fecal SEPT-9 and miRNA-34b/c gene methylation yields high clinical performance for colorectal tumor screening. Methylated SEPT-9 and miRNA-34b/c genes may be a new panel of biomarkers for colorectal tumor screening in large-scale population. The performance of combined detection of multi-gene methylation detection is better compared with that of single gene.

【Key words】Colorectal cancer;SEPT-9;miRNA-34b/c;Methylation;

Methylation-sensitive high-resolution melting

大腸癌是常見的消化道腫瘤之一，我國大腸癌發病率繼胃癌、肺癌、食管癌之后排第4位，且呈上升趨勢[1]。和其他惡性腫瘤不同的是，大腸腫瘤早期篩查、早期診斷、早期治療能顯著降低大腸癌的發病率和病死率，改善預后，有重大社會意義。目前，尚無行之有效的大腸腫瘤大規模篩查方法。DNA甲基化是大腸腫瘤發生發展過程中的一個早期事件，研究證實通過檢測糞便DNA/微RNA（miRNA）基因的甲基化可早期篩查大腸腫瘤，并且多基因聯合檢測的篩查性能優于單基因檢測。目前有較多的糞便DNA/miRNA基因甲基化標志物被研究用于大腸腫瘤篩查，其中SEPT-9和 miRNA-34b/c基因被證實具有較好的篩查性能[2-6]。

基于此，本研究評估聯合檢測糞便SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化對大腸腫瘤篩查的臨床性能，以期尋求更好的大腸腫瘤篩查標志物組合。

對象與方法

一、研究對象

1. 標本來源及相關臨床資料

收集2017年1月至2017年7月我院術前大腸癌患者、術前大腸腺瘤患者及腸鏡受檢者的糞便標本及臨床資料。共搜集糞便標本如下：根據納入及排除標準，總共入組35例大腸癌 、47例大腸腺瘤、52例正常對照組。大腸癌組中，男女比例19∶16，年齡（58.72±2.34）歲;大腸腺瘤組中，男女比例25∶22，年齡（55.50±1.78）歲。按年齡、性別匹配的正常對照組中，男女比例25∶27，年齡（53.67±2.13）歲。大腸癌組、大腸腺瘤組、正常對照組的性別構成、年齡比較差異均無統計學意義（P均> 0.05），具有可比性。研究對象對本研究均知情同意。

2.納入與排除標準

病例組納入標準：①年齡≥40歲，病理組織學檢查（均由一位經驗豐富的胃腸道病理學專家閱片判定）確診為結直腸腺瘤或大腸癌患者;②能收集合格糞便樣本的患者。病例組排除標準：①家族性或遺傳性結直腸腺瘤或腫瘤;②非原發癌灶者及不能確診等其他情況;③合并其他系統或器官腫瘤;④同時患有炎癥性腸病者;⑤術前有放射治療或化學治療史;⑥妊娠或有嚴重肝腎功能不全者;⑦肉眼見全血性大便者。正常對照組納入標準：①年齡、性別與大腸癌組、大腸腺瘤組匹配;②腸鏡檢查陰性;③能收集到合格糞便樣本。正常對照組排除標準：①合并其他系統或器官腫瘤;②妊娠或有嚴重肝腎功能不全者。

二、主要試劑

糞便DNA提取試劑盒、高分辨率熔解（HRM）分析試劑盒;亞硫酸氫鹽修飾試劑盒、100%甲基化DNA標準品、0%甲基化DNA 標準品;HRM引物由上海生工公司合成。

三、實驗儀器

PCR 擴增儀;LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR 儀;紫外分光光度計;-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱;電子天平;臺式高速低溫離心機;渦旋振蕩器。

四、實驗方法

使用糞便DNA提取試劑盒提取糞便DNA;對提取的DNA進行亞硫酸氫鹽修飾;在Light Cycler 480 Ⅱ螢光定量 PCR儀上按設計的引物擴增目的基因CpG島，后采用Gene Scanning分析其甲基化狀態;結果判定：構建各基因甲基化標準熔解曲線，依據所檢測標本熔解曲線在標準熔解曲線中的相對位置，判斷其是否存在甲基化;結果由2名研究人員分別判斷，如意見不同，則再次實驗?；蚵摵蠙z測結果判定：任一基因甲基化陽性則結果記錄為陽性，兩基因甲基化均陰性記錄為陰性。

五、統計學處理

應用SPSS 20.0進行統計學分析。正態分布資料以表示，組間比較采用單因素方差分析;計數資料以例（%）表示，多組間比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用Bonferroni法校正檢驗水準;組內不同檢測指標比較采用配對χ2檢驗。α = 0.05。

結果

一、提取的糞便DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

從糞便標本中提取的DNA條帶亮度高且條帶單一，分子量均大于2000 bp，提示提取DNA濃度高，較純，見圖1。

二、3組糞便SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化陽性率比較

3組的SEPT-9、miRNA-34b/c基因甲基化陽性率比較差異均有統計學意義（χ2SEPT-9 = 37.185，χ2miRNA-34b/c = 40.040，P均< 0.001），利用Bonferroni法校正檢驗水準進行兩兩比較，大腸癌組和大腸腺瘤組的甲基化陽性率比較差異無統計學意義，兩者與正常對照組比較差異均有統計學意義（P均< 0.001）。大腸癌組和大腸腺瘤組聯合檢測SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化陽性率均高于SEPT-9單基因檢測和miRNA-34b/c單基因檢測（P均< 0.05），見表1。

討論

大腸癌和其他惡性腫瘤不同之處在于大腸癌早期和晚期預后差別巨大。篩查及診斷早期大腸腫瘤，予以腸鏡下切除，或者行外科手術切除，可以降低大腸癌的發病率和病死率。因此，早期篩查大腸腫瘤意義重大。

作為一種新的大腸腫瘤無創篩查標志物，DNA甲基化被部分研究證實具有良好的篩查性能，然而暫時只有個別基因甲基化檢測應用于臨床，仍需進一步驗證其性能以及找尋更多具有良好篩查性能的基因甲基化標志物或組合。有研究證實，多基因聯合檢測性能優于單基因檢測[7]。目前有大量DNA甲基化標志物被研究用于大腸腫瘤篩查，有較多研究報道SEPT-9和miRNA-34b/c有較好的大腸腫瘤篩查性能。甲基化敏感性HRM法檢測糞便基因甲基化，已被本課題組之前的研究證實具有良好性能[5， 8-9]。 因此，在前期研究的基礎上，本研究進一步探索聯合檢測大腸腫瘤患者糞便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化，以評價其篩查大腸腫瘤的性能。

本研究通過病例對照研究，分別檢測大腸腫瘤患者及正常對照人群糞便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化情況，并將甲基化情況和研究對象的臨床特征進行統計分析，發現SEPT-9和miRNA-34b/c基因在大腸癌和大腸腺瘤中有較高的甲基化率，在正常人群中甲基化率較低，與現有文獻報道的甲基化率相符，進一步證實了上述2種基因甲基化檢測篩查大腸腫瘤的性能。然而本研究樣本量不夠大，且未對不同分期、不同分化程度大腸癌進行亞組分型，或許DNA甲基化亦可作為大腸癌分期及惡性程度的輔助指標[10]。

綜上所述，SEPT-9和miRNA-34b/c基因是具有較好篩查大腸腫瘤性能的標志物組合，或許將來可大規模應用于臨床篩查大腸腫瘤，但仍有大量工作需要我們進一步開展，如更大樣本量的研究，以及對大腸癌分亞組以研究大腸癌不同分期的甲基化情況，對甲基化與大腸腫瘤發生發展機制的進一步探索等。

參 考 文 獻

[1] 李道娟， 李倩， 賀宇彤.結直腸癌流行病學趨勢.腫瘤防治研究，2015，42（3）：305-310.

[2] 蔡克銀， 徐梅華， 王曉. 糞便DNA中聯合SFRP1及SEPT9基因甲基化檢測對老年性結直腸癌早期診斷的臨床研究.臨床腫瘤學雜志，2018，23（1）：25-29.

[3] 石會勇， 趙春紅， 甄亞男， 霍守俊， 王若谷. 外周血SEPT9基因甲基化檢測在結直腸癌篩查及術后隨訪中的意義分析.中華普外科手術學雜志（電子版），2019，13（1）：65 -68.

[4] 劉益，苗進. SEPT9甲基化與多種血清腫瘤標志物對結直腸癌診斷價值的比較.中國中西醫結合消化雜志， 2020， 1（5）：360-363.

[5] 周淑珠.甲基化高分辨率溶解曲線分析檢測糞便microRNA34b/c/vimentin甲基化篩查結直腸腫瘤的研究.湛江：廣東醫科大學，2016.

[6] Wu XD， Song YC， Cao PL， Zhang H， Guo Q， Yan R， Diao DM， Cheng Y， Dang CX. Detection of miR-34a and miR-34b/c in stool sample as potential screening biomarkers for noninvasive diagnosis of colorectal cancer. Med Oncol，2014，31（4）：894.

[7] 邵書先， 廖秀軍， 張延祥， 裘建明， 張秀峰， 楊關根. 多基因聯合提高結直腸癌甲基化檢測陽性率的研究.中華胃腸外科雜志，2012，15（6）： 629-632.

[8] 肖著軍， 蕭著玲， 陳金敏， 鄧飛鴻， 許岸高.甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析篩查大腸癌的性能評價. 重慶醫學，2015，44（2）：186-188，191.

[9] 肖著軍， 王新穎， 李丙生， 李釗， 馬群英， 朱偉思， 王國振，林金鳳，許岸高. 聯合檢測vimentin和SFRP2 甲基化在大腸癌篩查中的應用評價. 現代消化及介入診療， 2014， 19（1）：13-16，20.

[10] 溫機智， 韓曉燕， 衛洪波， 陸慧瓊， 張富程.結腸癌組織FOXF1基因甲基化檢測及其臨床意義. 新醫學， 2013， 44（6）：370-373.

（收稿日期：2021-03-18）

（本文編輯：楊江瑜）