60Coγ射線引起Wistar大鼠放射性皮膚損傷的實驗研究

朱貴花 黃從書 劉桂芳 謝光輝 馬增春 楊 凌 高 月

1（江西中醫藥大學 南昌 330004）

2（廣東藥科大學 廣州 510006）

3（軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所 北京 100850）

4（空軍杭州特勤療養中心 杭州 310002）

放射性皮膚損傷不僅是核爆炸、核事故、核燃料處理中的主要傷情，95%以上的臨床放療患者也會出現放射性皮膚損傷。輕度損傷可自愈，重則劇烈疼痛，繼發感染，潰瘍，壞死［1］。放射性皮膚損傷具有預后不良、易反復、難以治愈等特點，嚴重影響涉核人員工作效能和公眾健康［2］。因此，對急性放射性皮膚損傷評估體系、發生發展機制及防治藥物的研究越來越受到國內外相關學者的關注，其研究的首要目標是建立可評價的動物模型，探索其變化特征，以利于藥物開發研究。根據相關文獻報道，X射線及60Coγ射線均可用于放射性皮膚損傷模型的建立，兩種射線對機體的損傷有其不同的特點和規律。X射線是臨床上放化療時最常用的射線，能量高、劑量分布均勻、對稱性好、穿透性強。目前常選用X射線建立該模型并進行相關研究，并取得了較好的效果。而60Coγ射線在放射性皮膚損傷模型的建立及相關報道較少，但臨床上有些地區仍然使用60Coγ射線進行放射治療［3-6］。因此，本研究采用60Coγ射線進行造模，通過觀察不同劑量的60Coγ射線引起的放射性皮膚損傷，從而找到建立大鼠放射性皮膚損傷模型的最佳方案，為放射性皮膚損傷的進一步研究奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

清潔級雌性Wistar大鼠，8周齡，體重（200±20）g，購自北京維通利華有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養于軍事醫學研究院輻射醫學研究所27號院動物房。實驗經軍事醫學研究院輻射醫學研究所動物倫理委員會審核批準，批準編號：IACUC-DWZX-2020-773。

1.2 儀器

60Coγ射線放射源（軍事醫學研究院輻射醫學研究所）；激光多普勒血流儀MOORLDI2-BI（摩爾科學儀器有限公司）；脫水機VIP-6（日本櫻花）；包埋機KD-BM及組織攤片機KD-P（科迪儀器設備有限公司）；病理切片機RM2016（科迪儀器設備有限公司）；顯微鏡Nikon Ci-S及成像系統DS-FI2（日本尼康）。

2 方法

2.1 動物分組

Wistar大鼠隨機分為3組：正常對照組（Normal control，NC，n=6）、30 Gy照 射 組（Radiation，30 Gy，n=10）和45 Gy照 射 組（Radiation，45 Gy，n=10）。正常對照組不接受照射，其余各組接受臀背部照射。照射前將所有動物使用電推刀將大鼠臀背部皮膚去毛。

2.2 動物皮膚輻射損傷模型的建立

照射前使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。除正常組外，所有大鼠俯臥位固定于特制模板上，采用60Coγ射線單次局部輻照大鼠臀背部皮膚，非照射部位用10 cm厚的鉛磚屏蔽，源皮距為2 m，照射面積為5 cm×3 cm，吸收劑量率217.34 cGy/min，兩組實際輻照時間分別為20.49 min和13.48 min，總劑量分別為45 Gy和30 Gy，建立放射性皮膚損傷模型。

2.3 觀察指標

（1）觀察照后大鼠一般情況，包括大鼠的飲食攝水及體重變化情況，記錄大鼠照射區皮膚變化情況并采用皮膚半定量評分方法［3-4］：1分為正常皮膚；1.5分為輕度紅斑、干燥；2分為中度紅斑、干燥；2.5分為明顯紅斑、干燥脫屑；3分為干燥脫屑、輕度干燥結痂；3.5分為干燥脫屑、結痂，表皮少量結痂；4分為斑片狀濕潤脫屑，中度結痂；4.5分為融合性濕性脫屑，潰瘍，大量深的結痂；5分為開放性傷口，全層皮膚脫落。（2）照射區皮膚血流檢測：使用激光多普勒血流儀測定照后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d、60 d大鼠臀背部血流變化。（3）皮膚組織病理學觀察：各組大鼠于照后60 d，取照射區域皮膚組織，使用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后進行切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組大鼠皮膚組織結構改變。

2.4 統計學分析

使用Graphpad prism 5.0軟件進行統計學分析，數據以±s表示，大鼠體重、皮膚評分、血流變化采用多因素方差分析進行組間比較，大鼠表皮、真皮厚度采用單因素方差分析進行組間比較，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01時差異極顯著。

3 結果

3.1 動物一般情況

與NC組相比，30 Gy和45 Gy照射組大鼠在照后2周攝食、飲水均減少，體重下降，45 Gy照射組下降更明顯（與NC相比，**p＜0.01，***p＜0.001），活動減弱，后慢慢恢復正常，體質量呈逐漸增加的趨勢（圖1）。在照后第14天出現皮膚損傷后，30 Gy和45 Gy照射組大鼠性情暴躁，精神亢奮，活動增多。

圖1 照后不同時間各組大鼠體重變化Fig.1 Changes of body weight at different time after irradiation of all group rats

3.2 不同劑量60Coγ射線對大鼠皮膚損傷的影響

大鼠經不同劑量的60Coγ射線照射后，均出現不同程度的皮膚損傷（圖2）。照后7 d，各組大鼠照射區皮膚均無明顯變化；照后14～18 d，30 Gy組大鼠出現輕度脫屑，45 Gy組大鼠脫屑明顯，并伴有輕度紅斑，傷口均未出現破損；照后21 d，30 Gy組大鼠出現顯著性紅斑、脫皮，皮膚輕微破損但無滲出液，皮膚損傷評分達最大（圖3），45 Gy組大鼠傷口破損、局部膿腫，伴有滲出液；照后28 d，30 Gy組大鼠創面面積穩定，傷口輕度結痂，45 Gy組大鼠創面結痂，傷口范圍穩定，皮膚損傷評分達最大值（圖3）；照后60 d，30 Gy組大鼠創面有新生上皮長出，與正常皮膚相似，45 Gy組大鼠創面有部分傷口仍未愈合。

圖2 照后不同時間各組大鼠皮膚變化Fig.2 Changes of skin at different time after irradiation of all group rats

圖3 使用皮膚半定量評分評估各組皮膚損傷程度1.0（無損傷）至5.0（嚴重損傷）Fig.3 Assessment of skin injury in each group using semiquantitative grading from 1.0(no injury)to 5.0(severe injury)

3.3 照后不同時間各組大鼠皮膚血流變化

照后不同時間各組大鼠皮膚血流變化情況見圖4和圖5。照后60 d，與NC組相比，各組大鼠血流均出現明顯變化（圖4）。由圖4可知，照后7 d，兩組大鼠皮膚血流與正常接近；照后14 d，兩組大鼠皮膚血流升高，這時皮膚出現脫屑，血管擴張；照后21～28 d，30 Gy組大鼠血流維持在較高水平，考慮與大鼠創面出現紅斑有關；照后35～60 d，30 Gy組大鼠皮膚血流與正常逐漸接近，說明傷口逐漸恢復、開始愈合；照后21 d，45 Gy組大鼠血流減少，考慮與大鼠出現潰瘍有關。

圖4 照后不同時間各組大鼠皮膚血流變化Fig.4 Changes of the skin blood flow at different time after irradiation of all group rats

圖5 照后不同時間點各組大鼠血流值變化情況；***p＜0.001，與正常相比Fig.5 Changes of the skin blood flow values at different time after irradiation of all group rats;***p＜0.001,compared with NC group

照后28 d，45 Gy組大鼠血流增加（***p＜0.001），考慮與大鼠創面愈合過程中肉芽組織大量增生有關。照后35～60 d，45 Gy組大鼠血流與30 Gy組相似（圖5）。

3.4 觀察各組皮膚組織病理形態學改變

正常的皮膚組織皮膚層結構正常，真皮層含有一定數量的毛囊、皮脂腺、汗腺，形態結構正常，皮下組織血管無充血、淤血及炎性細胞浸潤；照后60 d，30 Gy組大鼠局部可見表皮層增厚（p＜0.001），鱗狀上皮細胞數量增多（黑色箭頭）；真皮層膠原纖維含量豐富、排列規則，可見毛囊、皮脂腺等附屬器官，未見明顯炎癥。45 Gy組大鼠可見表皮明顯增厚，鱗狀上皮細胞數量增多（黑色箭頭），少見鱗狀上皮細胞胞質空泡化（黃色箭頭）；真皮層可見少量纖維細胞（紅色箭頭），并伴有淋巴細胞點狀浸潤（藍色箭頭），未見毛囊、皮脂腺等附屬器官（圖6）。正常的皮膚組織表皮層較薄，真皮層內可見大量的皮膚附屬器如皮脂腺、毛囊、汗腺等，它們的存在對于維持皮膚的正常功能具有重要作用。經照射后，可以發現45 Gy組大鼠表皮層明顯增厚（p＜0.001），且皮膚附屬器數量減少，使皮膚失去了正常功能（圖7）。

圖6 照后60 d各組大鼠皮膚組織病理改變；彩色見網絡版（HE,200×）Fig.6 Pathological changes of rats skin tissues at 60 d after irradiation of all group rats;color online(HE,200×)

圖7 照后60 d各組大鼠表皮厚度；***p＜0.001，與正常相比Fig.7 The average of epidermal thickness at 60 d after irradiation of all group rats;***p＜0.001,compared with NC group

4 討論

放射性皮膚損傷是放射性損傷中較為常見的一種類型，主要發生于單次大劑量照射或多次小劑量照射的患者及與輻射相關的工作者。當射線作用于皮膚時，會使皮膚血管內皮細胞受到損害，導致毛細血管損傷，血管通透性增加，炎性滲出，微血栓形成及微血管阻塞，進而導致皮膚微循環障礙，加重皮膚損傷。臨床表現為紅斑、瘙癢、脫屑、潰瘍、壞死等［7］癥狀。病理學變化為表皮增生、纖維化、炎性浸潤、皮膚附屬結構減少等［8］。因此，為深入探討放射性皮膚損傷的發生發展機制及治療方法，需要建立放射性皮膚損傷的動物模型。

對于放射性皮膚損傷動物模型的建立，在動物種類的選擇上主要有小鼠、大鼠、新西蘭大白兔及小型豬［9-12］。小鼠體積小，不易照到局部皮膚；而新西蘭大白兔、小型豬體積大，操作不便。照射部位多選用臀背部或雙后肢，該部位重要臟器少，便于觀察。因此，本次實驗選用雌性Wistar大鼠作為造模動物，臀背部皮膚作為照射區域。

目前，放射性皮膚損傷模型的建立主要集中于X射線的研究。相關學者分別選用單次劑量45 Gy、38 Gy、40 Gy、41.5 Gy成功建立了放射性皮膚損傷模型［13-16］。賴梅生等［17］選用單次吸收劑量38 Gy的X射線，觀察荊芥連翹湯預防性內服對大鼠放射性皮炎的防治作用；李洋等［18］選用單次吸收劑量40 Gy的X射線，探討水凝膠治療大鼠放射性皮炎愈合過程中創面愈合率及其機制。因不同直線加速器產生的X射線，選用的劑量存在一定的差別，但可以發現不管是造模劑量還是藥物觀察劑量，選用X射線建立放射性皮膚損傷模型的最佳劑量為40 Gy左右。因60Co源的特殊性，對不同劑量60Coγ射線誘發放射性皮膚損傷的報道較少。部分研究者分別使用單次劑量60 Gy、45 Gy、30 Gy、22 Gy60Coγ射線進行造模［19-22］，可以發現劑量梯度較大。因此，本實驗選用60Coγ射線進行造模。結合前期相關劑量摸索的基礎上，發現當吸收劑量小于20 Gy時，大鼠的皮膚改變及病理變化極其輕微，不足以反映放射性皮膚損傷的特征。當吸收劑量為30 Gy、45 Gy時，其皮膚變化與病理改變較為明顯。因此，本次實驗選用30 Gy、45 Gy作為進一步研究的劑量。

輻射會導致皮膚微循環障礙，通過檢測照射野大鼠皮膚血流變化，可以得出：與正常組相比，30 Gy組、45 Gy組大鼠照射區皮膚血流在紅斑期及愈合期血流增加，30 Gy組在輻射中期維持在較高水平，45 Gy組大鼠照射區皮膚血流在潰瘍期降低。因此，我們可以得出照射區皮膚血流在紅斑出現時，血流增加；在潰瘍出現時，血流降低；創面愈合初期時，血流增加，創面愈合后期時降低。

本研究結果顯示，30 Gy組、45 Gy組均能建立放射性皮膚損傷模型，但其損傷程度不同。30 Gy組60Coγ射線照射組大鼠皮膚損傷較輕，真皮層可見毛囊、皮脂腺等附屬器官，為輕度炎癥病變。45 Gy組照射野皮膚遵循紅斑、瘙癢、炎性、潰瘍及愈合等規律；鏡下可見表皮增厚，局部真皮層可見少量纖維細胞，并伴有淋巴細胞點狀浸潤，皮膚附屬器減少，為中度炎癥病變。結合照后大鼠皮膚變化、血流變化和病理變化，可以發現45 Gy組更符合放射性皮膚損傷的發生發展過程。綜上所述，采用45 Gy的60Coγ射線可獲得較佳的放射性皮膚損傷模型，該模型易于觀察，取材方便，皮膚損傷明顯，可為放射性皮膚損傷的進一步研究奠定基礎。