活血解毒方通過修復表皮屏障減輕銀屑病樣小鼠皮損復發表現*

劉 宇， 李 萍， 王 燕， 底婷婷， 蒙玉嬌， 郭簡寧，郭肖瑤， 齊 聰， 趙京霞△

（1首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京市中醫研究所，銀屑病中醫臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京100010；2北京中醫藥大學，北京100029）

銀屑病是一種難治性皮膚科常見病，表現為皮膚紅斑、鱗屑、增厚。研究證實銀屑病患者存在著表皮屏障的損傷［1］，緊密連接的異常直接影響表皮通透屏障功能，銀屑病患者皮損中被證實存在著緊密連接蛋白的異常表達［2］。研究發現，銀屑病患者外用保濕劑可以改善其受損的表皮屏障功能，并預防、延緩銀屑病復發［3］，但中藥對緊密連接的調節作用及對銀屑病復發的影響卻不甚明確。

血瘀證是銀屑病慢性期的中醫證候之一，有反復發作、遷延難愈等特點?；钛舛痉剑℉uoxue-Jie?du decoction，HXJD）是針對銀屑病血瘀證的常用方劑。臨床研究和基礎研究均已明確發現HXJD的有效性，并發現該方可減緩銀屑病的復發，但具體作用機制尚不明確［4-5］。涼血解毒方（Liangxue-Jiedu de?coction，LXJD）是臨床治療銀屑病證屬血熱的常用方，多用于急性期銀屑病。因此，本研究對比LXJD，觀察HXJD對銀屑病樣小鼠皮損緊密連接及對復發模型小鼠皮損的干預作用，為中藥延緩銀屑病復發提供生物學證據。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，體質量20~22 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號為SCXK（京）2014-0004，飼養于北京市中醫研究所動物室。實驗經北京市中醫研究所實驗動物管理委員會批準，倫理號為2018100202。

1.2 藥物 咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業有限責任公司）；氨甲蝶呤（methotrexate，MTX）片（上海信誼藥廠有限公司）；HXJD（組成為：白花蛇舌草、莪術、鬼箭羽、雞血藤、桃仁、丹參、當歸、元參、威靈仙、桂枝、蒼術、草河車）；LXJD（組成為土茯苓、生槐花、紫草、生地黃、赤芍、白鮮皮、草河車、丹皮、白茅根、防風、白花蛇舌草、板藍根）；中藥材來源于首都醫科大學附屬北京中醫醫院中藥房。

1.3 試劑與儀器 過氧化物酶封閉液、DAB顯色液和熒光封片劑（中杉金橋）；抗Ki67、CD3、loricrin、claudin-1和claudin-7抗體（Abcam）；抗occludin抗體（Proteintech）；Alexa Fluor?488山羊抗兔IgG（冠星科技有限宇公司）；BCA試劑盒（Thermo）。

組織脫水機（型號ASP300S）、包埋機（型號EG1140C）和HE半自動染色儀（型號AUTOSTAIN?ERXL）均購自Leica；正置熒光顯微鏡及圖像分析系統（型號IMAGERZ2）購自Zeiss。

2 方法

2.1 分組與模型制備 采用咪喹莫特誘導銀屑病樣皮損的經典模型［5］，給藥劑量參考課題組前期實驗結果［6］。小鼠腹腔注射80 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，背部刮毛約2 cm×2 cm。隨機分成5組，空白對照（control）組、模型（model）組、陽性藥（MTX）組、HXJD組和LXJD組，每組9只，單籠飼養。除空白對照組外，予5%咪喹莫特乳膏62.5 mg外用，日1次，空白對照組予等量凡士林。6 d后，每組隨機處死6只小鼠，剩余小鼠，正常飼養29 d后，重新備皮，要求同前，于第37天除空白對照組外，其余4組均予外涂咪喹莫特誘導銀屑病復發模型，共5 d。

2.2 給藥方法 造模同時灌胃給藥，陽性藥組予MTX（1 mg/kg，0.9%生理鹽水溶解），HXJD組和LXJD組予相應水煎劑，空白對照和模型組予生理鹽水，每天1次，每次0.2 mL。復發模型造模時，不給藥。

2.3 小鼠的皮損表現及PASI評分 每天對小鼠皮損進行拍照，并根據紅斑、鱗屑和浸潤進行嚴重程度評分，3項相加即為總分。以縱坐標為各組小鼠3項得分及總分的平均值、橫坐標為時間繪制折線圖，觀察小鼠皮損變化。

2.4 小鼠皮膚表皮含水量的檢測 第1次取材前，用水油筆檢測各組小鼠背部皮損表皮含水量，重復3次，取均值繪制柱狀圖。

2.5 小鼠皮損的病理學改變檢測 組織經固定、脫水后，制成5μm石蠟切片，進行HE染色。每個標本選4張染色切片觀察組織病理學改變，并在20倍及40倍物鏡下拍照，對40倍物鏡下圖片采用ZEN圖像分析系統測量表皮厚度。

2.6 小鼠皮損表皮細胞增殖分化標志分子的檢測 分別采用免疫熒光法和免疫組化法檢測小鼠皮損Ki67和loricrin的表達。石蠟切片經脫蠟及抗原修復后，過氧化物酶封閉液室溫封閉10 min，10%山羊血清37℃孵育30 min，加入Ki67（1∶400）和loricrin（1∶200）Ⅰ抗4℃孵育過夜。Ki67用Alexa Fluor?488標記的熒光Ⅱ抗（1∶800）37℃孵育1 h后，DAPI封片；loricrin用羊抗兔IgG抗體37℃孵育1 h后顯色封片。顯微鏡下觀察，并計算陽性細胞數及平均吸光度。

2.7 免疫組化法檢測小鼠皮損 CD3+T細胞的浸潤檢測步驟同loricrin，但Ⅰ抗稀釋比為1∶50。正置光學顯微鏡下觀察CD3+T細胞的浸潤情況。

2.8 免疫組化法檢測小鼠皮損表達緊密連接蛋白的表達 檢測步驟同loricrin，抗claduin-1、claudin-7、occludin的Ⅰ抗稀釋比均為1∶200。正置光學顯微鏡下觀察蛋白的定位及表達，并計算陽性細胞數及平均吸光度。

2.9 Western blot檢測小鼠皮損occludin的表達研磨提取皮膚組織蛋白，經定量、變性、電泳、電轉后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，Ⅰ抗（1∶1 000）4℃搖床孵育過夜，Ⅱ抗（1∶10 000）室溫搖床避光孵育1 h后，掃膜并對條帶進行灰度分析。

3 統計學處理

采用SPSS17.0及GraphPad Prism 6.0軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。組間均數比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HXJD減輕銀屑病樣小鼠的皮損表現

Control組小鼠背部皮膚光滑，顏色為肉紅色。隨著咪喹莫特的涂抹，model組小鼠皮損出現紅斑、鱗屑、浸潤等銀屑病樣表現。與model組相比，用藥組的皮損表現均減輕。PASI評分趨勢圖提示，各組小鼠在用藥第2天，出現紅斑、鱗屑、浸潤等表現；用藥3天后，各組小鼠在3項評分中逐漸出現差異趨勢；在總分圖中，model組最為嚴重；與model組相比，HXJD組和LXJD組嚴重程度減低；MTX組皮損嚴重程度最輕。對比HXJD和LXJD發現，HXJD對小鼠皮損的緩解作用較差。見圖1。

2 HXJD有效恢復銀屑病樣小鼠的表皮屏障功能

與control組相比，model組小鼠第7天表皮含水量明顯降低（P<0.05），提示其表皮通透屏障受損；與mode組相比，HXJD組小鼠表皮含水量升高（P<0.05）；對比兩中藥組發現，HXJD組的表皮含水量明顯升高（P<0.05），提示其有效恢復受損表皮通透屏障，見表1。

3 HXJD減輕銀屑病樣小鼠的表皮厚度

病理觀察可見第7天comtrol組小鼠皮膚表皮薄，真皮淋巴細胞浸潤較少；model組小鼠表皮明顯增厚（P<0.05），表皮細胞角化不全，真皮大量淋巴細胞浸潤；與model組相比，給藥組表皮變?。≒<0.05），真皮淋巴細胞浸潤減少；對比兩中藥組發現，HXJD組表皮厚度較LXJD更厚（P<0.05），見圖2及表1。

表1 活血解毒方對銀屑病樣小鼠表皮含水量和皮損表皮厚度的干預作用Table 1.Effect of Huoxue-Jiedu decoction（HXJD）on the mois?ture content and thickness of psoriatic mouse epider?mis（Mean±SD.n=6）

4 HXJD減輕銀屑病樣小鼠表皮細胞的異常增殖分化標志分子的表達

免疫熒光法檢測各組小鼠Ki67的表達，陽性顯示為綠色。結果顯示，control組表皮基底層有少量陽性表達；model組較control組表達明顯增多（P<0.05）；與model組相比，MTX組、HXJD組和LXJD組中陽性表達明顯減少（P<0.05）；對比兩中藥組發現，HXJD組較LXJD組陽性表達明顯減少（P<0.05），見圖3及表2。

免疫組化法檢測各組小鼠loricrin的表達，陽性顯示為棕色。在control組中，loricrin呈細線狀表達在表皮角質層；與control組相比，model組蛋白表達減少（P<0.05）；與model組相比，MTX組、HXJD組和LXJD組均增加了loricrin的表達（P<0.05）；對比兩中藥組，HXJD可將loricrin濃縮至角質層，促進形成角質層屏障，幫助修復受損的表皮通透屏障，而LXJD組蛋白仍舊彌散表達在表皮上層，見圖3及表2。

5 HXJD減少銀屑病樣小鼠皮損的T淋巴細胞激活浸潤

CD3標記皮膚中激活的T淋巴細胞，陽性顯示為棕色。在control組，真皮中可見少量棕色陽性顆粒；與control組相比，model組陽性點明顯增多（P<0.05）；與model組相比，MTX組、HXJD組和LXJD組中CD3+T細胞明顯減少（P<0.05），見圖3及表2。

表2 活血解毒方對銀屑病樣皮損Ki67、loricrin和CD3表達的影響Table 2.Effect of Huoxue-Jiedu decoction（HXJD）on the ex?pression of Ki67，loricrin and CD3 in psoriatic mouse skin lesions(Mean±SD.n=3)

Figure 1.Effect of Huoxue-Jiedu decoction（HXJD）on the skin lesions of psoriatic mice.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs model group.圖1 活血解毒方對銀屑病樣小鼠皮損的干預作用

6 HXJD增加銀屑病樣小鼠皮損中緊密連接蛋白的表達

免疫組化法檢測各組小鼠皮損組織claudin-1、claudin-7和occludin的表達和定位，可見在control組抗claudin-1和claudin-7抗體均標記表皮細胞胞膜，表達連續，呈完整網狀；抗occludin抗體標記表皮細胞膜及胞漿，表達連續。與control組相比，model組中3種蛋白的表達均明顯減少（P<0.05），且表達完整性嚴重破壞，其中occludin標記表皮全層，出現異常定位。與model組相比，MTX組、HXJD組和LXJD組中3種蛋白的表達均有不同程度增加（P<0.05），且一定程度恢復表達的完整連續性。對比兩中藥組，HXJD組的claudin-1和claudin-7表達較LXJD組更高（P<0.05），occludin的表達較LXJD組的差異未見統計學顯著性。見圖4及表3。

表3 活血解毒方對銀屑病樣小鼠皮損claudin-1、claudin-7和occludin表達的影響Table 3.Effect of Huoxue-Jiedu decoction（HXJD）on the expression of claudin-1，claudin-7 and occludin in psoriatic mouse skin le?sions(Mean±SD.n=3)

Western blot提示，與control組比較，model組的occludin表達減少（P<0.05）；與model組相比，HXJD和LXJD組的occludin表達量有升高趨勢，但未見統計學顯著性，見圖5。

7 HXJD對銀屑病復發模型小鼠皮損表現及嚴重程度評分的影響

肉眼觀察到control組小鼠較初次造模，皮膚出現少量干屑，但無明顯紅斑及皮膚增厚；隨著咪喹莫特的涂抹，model組的皮損再次出現類似銀屑病樣皮損；與model組相比，MTX組的皮損鱗屑減少，紅斑減少不明顯，浸潤減輕；與model組相比，HXJD組和LXJD組的皮損表現明顯減輕。PASI評分趨勢圖提示，各組小鼠在咪喹莫特刺激的第2天，較初次造模，迅速出現了紅斑、鱗屑、浸潤等表現，且各組在以上方面出現了較為明顯的差異，在總積分圖中可看出model組最為嚴重；與model組比較，HXJD組和LXJD組小鼠的皮損嚴重程度降低，疾病發展趨勢緩慢，MTX組的皮損嚴重程度最重。對比兩中藥組，HXJD組的皮損浸潤、紅斑及總積分較LXJD組均明顯降低。見圖6。

Figure 2.Effect of Huoxue-Jiedu（HXJD）decoction on the pathological changes of psoriatic mouse skin lesions（HE staining，scale bar=20μm）.圖2 活血解毒方對銀屑病樣小鼠皮損病理學變化的影響

8 HXJD減輕銀屑病復發模型小鼠皮損表現

二次造模5 d后，control組皮膚表皮薄，皮下淋巴細胞浸潤較少；而model組小鼠皮膚增厚（P<0.05），真皮浸潤淋巴細胞增多，表皮細胞角化不全；與model組比較，MTX組、HXJD組和LXJD組的表皮不同程度變?。≒<0.05），且角化不全細胞明顯減少，淋巴細胞浸潤也有不同程度減少；對比兩中藥組，HXJD組表皮厚度較LXJD組明顯變?。≒<0.05），見圖7。

討 論

銀屑病是在一定遺傳背景下，由感染、代謝、應激等內外環境因素誘發的慢性炎癥性皮膚病，世界衛生組織已將其列為影響人類健康的重要疾病之一［7］。尋常型銀屑病是銀屑病最常見類型，目前西醫多采用維甲酸、光療、免疫抑制劑、靶向性生物制劑等進行治療并開展了多方面的探索，取得了一定進展，但銀屑病的長病程和高復發率，仍是困擾銀屑病患者的關鍵問題和治療瓶頸。據文獻報道，即使是治療效果比較好的生物制劑，如secukinumab［8］和secukinumab［9］，停藥后仍會在平均20~24周內復發。因此，探索有效的治療藥物和方法，證實其療效，進行推廣應用，具有重要意義。

Figure 4.Effect of Huoxue-Jiedu decoction（HXJD）on the expression of claudin-1，claudin-7 and occludin in psoriatic mouse skin lesions（scale bar=20μm）.圖4 活血解毒方對銀屑病樣小鼠皮損claudin-1、claudin-7和occludin表達的影響

Figure 5.Effect of Huoxue-Jiedu decoction（HXJD）on the expression of occludin in psoriatic mouse skin lesions.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs model group.圖5 活血解毒方對銀屑病樣小鼠皮損occludin表達的干預作用

皮膚形成表皮屏障，保護我們免受外界環境的傷害，同時控制水分流失［10］。緊密連接作為形成表皮屏障的重要部分，主要在表皮顆粒層發揮作用，形成有效的滲透性阻隔，維持內環境的穩態［11］。研究證實，銀屑病患者皮損中緊密連接蛋白表達異常［12］。緊密連接的異?？梢鸾琴|形成細胞異常的增殖分化，進而破壞表皮通透屏障，增加經皮水分丟失；另外，破壞的緊密連接為免疫細胞的遷移提供便利，加重免疫反應［13］；二者相互作用，最終表現為皮膚增厚、干燥，疾病遷延難愈。

Figure 6.Effect of Huoxue-Jiedu decoction（HXJD）on the skin lesions of mice with recurrent psoriasis induced by imiquimod.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs model group.圖6 活血解毒方對咪喹莫特二次誘導的銀屑病復發模型小鼠皮損的干預作用

Figure 7.Effect of Huoxue-Jiedu decoction（HXJD）on the pathological changes of skin lesions and the skin thicknessin the mice with recurrent psoriasis（scale bar=20μm）.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs model group；#P<0.05 vs LXJDgroup.圖7 活血解毒方對銀屑病復發模型小鼠皮損病理學變化和皮損表皮厚度的干預作用

尋常型銀屑病主要分為血熱證、血燥證和血瘀證3種證型。其中，血熱證占53.8%，血瘀證占18.1%［14-16］。LXJD和HXJD分別用于急、慢性期銀屑病，臨床療效良好?；A研究發現LXJD可有效減輕咪喹莫特誘導BALB/c小鼠的銀屑病模型表現，減少表皮細胞異常的增殖分化、抑制免疫細胞過度活化及相關炎性因子分泌，而HXJD對此模型的作用欠佳［6］。因此，本實驗采用慢性銀屑病動物模型進一步探究HXJD對銀屑病慢性期及復發的作用及機制。

本實驗選用C57BL/6J小鼠，咪喹莫特外涂進而誘導銀屑病樣動物模型。研究表明，C57BL/6J小鼠相較其他包括BALB/c在內小鼠品系的給藥表現與人類銀屑病表現更為相近［17］。且在已有研究中，銀屑病復發模型多選用C57BL/6J品系小鼠［18-20］。咪喹莫特是Toll樣受體激動劑，可以激活相關通路導致出現類似銀屑病表現，且該造模方式有一定自愈性，7 d左右達到皮損嚴重程度峰值，停藥約5天皮膚外觀即可恢復正常。國內外多個研究團隊在此基礎上，采用咪喹莫特二次刺激模型作為銀屑病樣皮損復發模型。本實驗參考第三軍醫大學團隊的造模方式，在初次外涂咪喹莫特6 d后，停止干預，繼續單籠飼養，30 d后再次外涂咪喹莫特誘導銀屑病樣皮損復發發現，二次誘導的小鼠的皮損出現更早，表現較初次更為嚴重［18］。

本實驗研究顯示，HXJD和LXJD均可改善銀屑病樣小鼠皮損表現，降低PASI評分，對比兩中藥組，LXJD對銀屑病樣小鼠皮損表現及表皮厚度的改善明顯優于HXJD，這與前期課題組研究結果一致［6］。在抑制炎癥方面，HXJD組CD3+T細胞的數量較LXJD組是增多的。而在屏障修復方面，對比LXJD組，HXJD可明顯升高皮損的表皮含水量以及緊密連接蛋白claudin-1、claudin-7和occludin的表達水平。以上結果明確了，HXJD主要通過調節緊密連接，修復表皮屏障起到緩解皮損表現的作用。

HXJD和LXJD均含有白花蛇舌草、草河車等清熱解毒藥物，但兩方側重點有所不同，HXJD用了大量活血及養血藥物，如雞血藤、丹參、當歸等，而LXJD則更加了生槐花、紫草等清熱涼血藥物的比例。我們前期研究發現，養血類藥物具有良好的調節緊密連接的作用，而清熱解毒藥物對緊密連接的調節作用不甚明顯［21］。且通過對比涼血方與LXJD，發現加入解毒藥后，可以有效抑制炎性因子的表達，提示解毒藥的作用靶點主要在抑制炎癥方面［22-23］。由上推測，HXJD因含有雞血藤和當歸等養血活血藥物，從而具有良好的修復表皮屏障的作用。

皮膚屏障一直是皮膚科關注的重點，通過本研究，我們已經明確HXJD對皮膚屏障有較好的修復作用。有臨床研究發現，銀屑病患者在易復發時節前涂抹保濕劑，可以提升表皮通透屏障功能并延緩皮損表現［3］。那么，HXJD是否具有減輕銀屑病樣皮損復發的作用？我們后續觀察了HXJD和LXJD對銀屑病復發模型小鼠皮損的影響。結果提示，無論從宏觀皮損還是組織學表現，HXJD可明顯減輕復發模型小鼠的皮損表現。對比LXJD，HXJD可明顯降低銀屑病復發模型小鼠的紅斑和浸潤，具有更好的緩解銀屑病樣小鼠復發皮損表現的作用。

綜上所述，HXJD通過調節緊密連接修復表皮屏障，從而減輕和延緩小鼠銀屑病樣皮損復發，也提示表皮屏障的修復可作為預防銀屑病復發的作用靶點?；趯嶒灲Y論，建議臨床治療慢性期銀屑病時，應注意使用活血、養血類藥物，慎用涼血類藥物。