HPLC-MS/MS檢測動物性食品中呋喃唑酮殘留量的方法研究

◎ 陳 燕，李康柏，許均圖，陳德斌，洪瑞申，王 景

（廣州華鑫檢測技術有限公司，廣東 廣州 510642）

呋喃唑酮是硝基呋喃類的一種，有良好的抑菌作用，可用于治療因細菌和原蟲引發的腸道疾?。ㄈ缒c炎，痢疾，潰瘍等）。呋喃唑酮經代謝后會產生呋喃唑酮代謝物，與呋喃唑酮一起經食物鏈積累到人體內，過量可導致頭暈、惡習和腹瀉等不良癥狀[1]。我國早在2008年就將包含呋喃唑酮在內的硝基呋喃類藥物列為禁用藥，不得在動物性食品中檢出[2]。

針對呋喃唑酮這一禁用藥物，我國制定了一系列行業標準和地方標準進行檢測，檢測對象主要包括飼料[3]、水產品[4]、動物性食品[5]，大都基于高效液相色譜法，但對于部分初級農產品及其加工食品不夠靈敏高效，所以開發靈敏可靠的檢測方法極為重要。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-三重四極桿質譜儀（安捷倫1200-6410）；漩渦振蕩器；旋轉蒸發儀（德國IKA RV 10 Basic V）；純水機（Millipore Milli-Q）；分析天平（賽多利斯BSA224S-CW）；分液漏斗；抽濾裝置。

二氯甲烷和甲醇為色譜純級別，購于漢尼韋爾公司；乙酸銨和無水硫酸鈉為分析純級別，購于廣州化學試劑廠。

1.2 呋喃唑酮標準溶液配制

標準品購自西格瑪公司，準確稱取10 mg呋喃唑酮，用50 mL甲醇超聲溶解，并用甲醇定容至100 mL，配成100 μg·mL-1的標準貯備液，放置于-18 ℃的冰箱中保存。實驗時，取儲備液放至室溫，根據需要配成適當濃度的標準工作液，現配現用。

1.3 儀器工作參數

（1）液相色譜條件。安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜分離柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：0.005 mol·L-1醋酸銨；流動相B：乙腈，A∶B=8∶2；流速：0.5 mL·min-1；進樣體積，10.0 μL。

（2）電噴霧離子源參數設置：正模式；溫度350 ℃；氣流速10 L·min-1；壓力345 kPa；電壓4 000 V；MRM多重反應監測。母離子和子離子質荷比參數設置如表1所示。

表1 呋喃唑酮的質譜參數設置表

1.4 測定步驟

（1）提取。稱取5.00 g（精確至0.01 g）樣品，置于50 mL離心管中，避光，加入15 mL二氯甲烷，振搖5 min，靜置分層，取下層二氯甲烷于100 mL梨形瓶中，再加入15 mL二氯甲烷重復提取一次，合并二氯甲烷，將所收集到的二氯甲烷提取液經無水NaSO4柱濾入梨形瓶中，再用10 mL二氯甲烷沖洗無水NaSO4柱，并用洗耳球吹出柱中液體，濾液于旋轉蒸發儀上45 ℃減壓蒸發溶劑至干。

（2）凈化。加入1 mL流動相至濃縮瓶，用漩渦振蕩器振蕩潤洗2 min，經0.22 μm濾膜后供液相色譜-串聯質譜測定。

（3）空白實驗。除不加試樣外，與試樣實驗同步進行。

1.5 結果計算

試樣中呋喃唑酮的含量X按式（1）進行計算。

式（1）中，X-試樣中呋喃唑酮的實際計算含量，μg·kg-1；CS-標準溶液中呋喃唑酮的理論濃度，ng·mL-1；A1-試樣液中呋喃唑酮的實際測試峰面積；A2-空白試驗的實際測試峰面積；V-試樣的定容體積，mL；AS-標準中呋喃唑酮的實際測試峰面積。

2 結果與分析

2.1 質譜參數的優化

取1.0 μg·mL-1標準溶液至樣品瓶中，在不經過色譜柱分離的情況下，分別于正、負離子模式下進行測試，確定呋喃唑酮的母離子為226.2，監測模式為正離子模式。通過二級質譜分析，確定在質荷比122.3處豐度最強，故選取作為定量離子，139.3作為定性離子。

2.2 提取試劑的優化

分別采用不同的提取試劑做單因子變量實驗，在添加水平0.10 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1、1.00 μg·kg-1三個濃度處分別做6組平行測試。用乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、環己烷作為提取試劑時，具體的回收率如表2所示。

表2 不同提取劑的呋喃唑酮回收率統計表

從表2分析可得，乙酸乙酯、正己烷、環己烷作提取試劑時回收率較差，選用二氯甲烷作為提取劑時回收率較好，故選取二氯甲烷作為提取試劑。

2.3 標準曲線繪制

配制濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1的呋喃唑酮標準溶液，依次通過C18反相色譜柱分離、電噴霧離子化后進入三重四極桿質譜分析，以標液濃度為橫坐標，對應濃度的儀器響應值為縱坐標繪制標準曲線。發現呋喃唑酮在0.5～20 ng·mL-1濃度范圍內線性關系較好，變異系數為0.998 7，擬合方程為y=769.68x-111.1，標準曲線如圖1所示。

圖1 呋喃唑酮的擬合曲線和方程圖

通過C18色譜柱分離，確定呋喃唑酮的保留時為3.2 min，子離子122.3和139.3響應靈敏，結果如圖2、圖3所示。

圖2 呋喃唑酮總離子流圖

圖3 呋喃唑酮多重反應監測譜圖

2.4 檢測方法評價

（1）靈敏度。應用本方法檢測動物性食品中呋喃唑酮，取3倍最低檢測信噪比對應的加標量為方法檢出限，10倍為定量限，算得檢測限為0.3 μg·kg-1，定量限1.0 μg·kg-1。

（2）準確度。本方法檢測食品中呋喃唑酮在0.5～20.0 ng·mL-1濃度范圍內的線性關系較好。 在0.10～1.00 μg·kg-1添加水平下，呋喃唑酮的回收率為74.6%～93.0%。

（3）精密度。應用本方法檢測動物性食品中呋喃唑酮,取羅非魚雞肉為樣品，做6個平行加標樣，加標含量為1.0 μg·kg-1，測得樣品濃度如表3所示，計算相對標準偏差RSD6為3.85。

表3 精密度計算表

3 結論

本實驗建立了HPLC-MS/MS測定動物性食品中呋喃唑酮殘留量的檢測方法，采用二氯甲烷作為提取劑，樣品提取液經凈化、濃縮后，由C18反相色譜柱分離，MRM模式定量檢測。該方法具有效率高、重現性好的特點，適用于動物性食品中呋喃唑酮殘留量的檢測。