液相色譜-串聯質譜法測定水果中吡蟲啉的不確定度評定

◎ 趙 飛

（遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧 沈陽 110000）

不確定度作為評價分析結果準確性的定量表征，其數值越小，表明結果準確性越高[1]。測量不確定度的評定是根據采用的檢測方法對待測組分進行檢測所得到的檢測數據評價的一種方式，也是評價檢測方法合理性、科學性的有效手段之一[2]。

吡蟲啉通過作用于昆蟲的乙酰膽堿受體，擾亂神經活動達到殺蟲效果，具有觸殺和胃毒雙重作用，應用較為廣泛[3]。由于吡蟲啉具有較強的內吸作用，不當使用后可能造成農藥殘留超標，給人體健康帶來安全隱患。此外，吡蟲啉對蜜蜂等傳粉生物具有較大毒性，可嚴重抑制蜂群數量的增長，間接影響環境生態平衡[4]。目前，吡蟲啉的檢測多采用高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯質譜法[5]?！妒称钒踩珖覙藴?食品中涕滅砜威、吡唑醚菌酯、嘧菌酯等65種農藥殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》（GB 23200.34—2016）中規定的方法可一次處理檢測多種農殘，本文按照該標準進行水果中吡蟲啉的檢測，并對檢測過程的不確定度進行系統的分析，為檢驗檢測實驗室按照該方法開展水果中吡蟲啉檢測提供科學的指導與依據。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Waters XEVO TQD液相色譜-串聯質譜儀（美國沃特世公司）；BSA224S-CW電子天平（德國賽多利斯公司）；GM200高速粉碎機（德國萊馳公司）；FJ300-SH均質器（德國IKA公司）；X1R高速冷凍離心機（德國Thermo公司）。

水果購于當地市場。丙酮、二氯甲烷、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；無水硫酸鈉、氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲酸（色譜純，上海安譜公司）；吡蟲啉標準物質（純度為98.5%，Dr. Ehrenstorfer）。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線配制

準確稱取吡蟲啉標準品20.52 mg于20 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即得濃度為1.0 mg·mL-1的標準儲備液。準確吸取0.1 mL濃度為1.0 mg·mL-1的標準儲備液用乙腈稀釋定容至100 mL，即得1.0 μg·mL-1吡蟲啉標準中間液?；|標準系列溶液：準確吸取標準中間液（1.0 μg·mL-1）0.25 mL、0.50 mL、1.0 mL、2.5 mL和5.0 mL于50 mL容量瓶中，用5%乙腈定容至刻度，配成標準系列工作液。準確移取以上各濃度標準系列工作液1.0 mL分別添加至經空白樣品前處理的殘渣中，渦旋混合均勻，制得5.0 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1基質標準系列溶液，臨用現配。

1.2.2 儀器條件

色譜柱：WATERS BEH C18，2.1 mm×50 mm；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。梯度洗脫程序：A為乙腈，B為0.1%甲酸水；0～0.5 min，A：5%；0.5～2.5 min，A：5%～95%；2.5～3.5 min，A：95%～5%。離子源溫度：150 ℃；檢測方式：MRM；毛細管電壓：2.0 kV；脫溶劑氣流量：800 L·h-1；脫溶劑氣溫度：400 ℃；定量離子255.9/174.8；定性離子255.9/208.9；錐孔電壓：34 V；碰撞電壓：12 V/16 V。

1.2.3 樣品制備

稱取10 g試樣，加10 mL水，靜置；再加40 mL丙酮，振蕩提??；上述溶液減壓抽濾，濾液合并濃縮。向濃縮液中加入氯化鈉溶液和二氯甲烷各30 mL，振蕩，移取二氯甲烷層；再向剩余溶液中加入30 mL二氯甲烷，重復上述操作，合并二氯甲烷層。二氯甲烷層經無水硫酸鈉脫水，濃縮至近干，加入2.0 mL SPE溶液溶解。將上述溶液轉入固相萃取柱（預先采用SPE溶液淋洗），收集流出液；再用SPE溶液洗滌固相萃取柱，收集流出液；流出液濃縮至近干，氮氣吹干；再加入一定體積乙腈，再用0.1%甲酸定容至1.0 mL，渦旋混勻，過濾膜待測。

1.2.4 數學模型的建立

建立測定樣品中吡蟲啉含量的數學模型（1）。

式（1）中，ω-樣品中吡蟲啉的含量，μg·kg-1；ρ-由標準曲線得出的樣液中吡蟲啉的濃度，ng·mL-1；ρ0-空白溶液中吡蟲啉的濃度，ng·mL-1；V-樣品定容體積，mL；c-系數；A-試樣溶液中吡蟲啉的響應值；As-標準溶液中吡蟲啉的響應值；m-水果樣品的稱樣量，g；P-水果空白基質的加標樣品回收率。

2 結果與分析

2.1 標準不確定度分量的評定

2.1.1 標準物質引入的不確定度ur(s)

（1）標準物質純度引入的不確定度ur(c1)。由標準物質證書可知，吡蟲啉的相對不確定度U=1.07%（k=2）。由標準物質純度引入的相對標準不確定度為：

（2）標準溶液配制引入的不確定度ur(c2)。標準品稱量采用分度為0.000 01 g天平，稱量范圍在0～50 g時，其最大允許誤差為±0.5 mg，按均勻分布計算，稱量操作過程中由使用的分析天平而引入的相對不確定度為：

準確吸取吡蟲啉標準儲備液0.1 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即得1.0 μg·mL-1吡蟲啉標準中間液。

使用0.1 mL的A級分度吸量管準確吸取0.1 mL吡蟲啉標準儲備液于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容，配制成吡蟲啉標準中間液，其質量濃度為1.0 μg·mL-1。該過程的不確定度來源主要由兩方面引入，一方面是使用的吸量管、容量瓶等玻璃器皿本身引入的，另一方面是由于操作時實驗室的溫度發生變化，進而導致量取的溶液體積變化而引入不確定度。0.1 mL的A級分度吸量管允許誤差為±0.002 mL，按照均勻分布考慮，則由此引入的不確定度為：

A級100 mL容量瓶的容量允許誤差為±0.10 mL，按照均勻分布考慮，取則容量瓶引入的不確定度為：

標準溶液配制室的溫度控制在（20±5）℃，20 ℃下乙腈的膨脹系數為1.37×10-3/℃，則由乙腈體積變化的相對標準不確定度為：

綜上，標準中間液配制過程引入的不確定度為：

（3）基質標準溶液配制引入的不確定度ur(c3)。由基質標準溶液配制引入的各分量相關情況見表1。

表1 基質標準溶液配制過程引入的分量表

根據各分量，基質標準系列溶液配制過程引入的 相對標準不確定度為：

（4）標準曲線擬合引入的不確定度ur(c4)。本方法采用優化后的儀器條件，分別對5個不同濃度的標準溶液進行測定，濃度依次為5.0 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1。以吡蟲啉的濃度為橫坐標、其響應峰面積為縱坐標，進行線性擬合，相關數據見表2。向陰性樣品中加標，并進行6次平行測定，測得加標樣品的測試液濃度分別為：45.6 ng·mL-1、45.2 ng·mL-1、45.0 ng·mL-1、45.3 ng·mL-1、45.7 ng·mL-1和45.4 ng·mL-1，平均值為45.4 ng·mL-1，由標準曲線引入的不確定度可由公式（2）計算。

表2 吡蟲啉基質標準曲線表

式（2）中，u(c4)-曲線擬合引入的不確定度；S(A)基質標準溶液中吡蟲啉響應值殘差的標準差；b-基質標準曲線的斜率；p-同一溶液測量次數（6次）；n-基質標準溶液的測定次數（5次）；c0-以基質標準曲線校正待測樣品濃度的平均值，ng·mL-1；ci-基質標準曲線各點濃度的理論值，ng·mL-1；c-i-基質標準曲線各點濃度的平均值，ng·mL-1。

由基質標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為ur(c4)為0.005 42。其中，S(A)可按公式（3）計算。

式（3）中，Ai-基質標準溶液各點的響應值；A-以基質標準曲線計算得到的理論響應值；n-基質標準曲線的點數。

綜上，標準物質引入的相對標準不確定度計算公式為：

2.1.2 樣品稱量引入的不確定度ur(m)

樣品稱量時采用分度為0.01 g的分析天平。0～50 g稱量范圍內該天平的最大允許誤差為±0.05 g，按均勻分布，由樣品稱量操作過程引入的相對不確定度為：

2.1.3 樣品前處理引入的不確定度ur(V)

提取過程中凈化后加入0.4 mL乙腈，再加入0.6 mL 0.1%甲酸水溶液。分別采用0.5 mL、1 mL分度吸量管進行添加，容量允差分別為±0.005 mL、±0.008 mL，該過程引入的相對標準不確定度為：

2.1.4 重復性引入的不確定度ur(R)

按照實驗方法，對陰性樣品進行加標實驗，添加量為5 μg·kg-1，測定值分別為：4.56 μg·kg-1、4.52 μg·kg-1、4.50 μg·kg-1、4.53 μg·kg-1、4.57 μg·kg-1和4.54 μg·kg-1，加標測試樣品的平均測定值為4.54 μg·kg-1，采用貝塞爾公式計算待測物的實際標準偏差為0.005 69，則相對標準不確定度為：

2.1.5 回收率引入的不確定度ur(P)

對陰性水果樣品進行加標實驗，添加量吡蟲啉的量相當于5 μg·kg-1，回收率分別為：91.2%、90.0%、90.6%、91.4%、90.8%和90.4%，平均值為90.7%，按照A類評定應用貝塞爾公式計算待測物的實際標準偏差為0.569%，其標準不確定度為：

采用t檢驗方法來判斷本實驗的回收率同100%之間是否存在顯著差異，若存在，需要采用回收率對結果進行修正。當n=6，在95%置信概率水平下t0.95(5)=2.571，該回收率下即t＞2.571，即檢測結果需采用回收率進行修正。

本實驗中，由回收率引入的相對標準不確定度為：

2.2 合成不確定度

綜合以上各分量，吡蟲啉的合成相對標準不確定度計算如下：

合成標準不確定度：u(x)=0.026 2×4.54=0.12 μg·kg-1。

2.3 擴展不確定度和結果表示

當置信概率在95%時，吡蟲啉檢測結果的擴展不 確 定 度為U95=k×u(x)=0.24 μg·kg-1（k=2）。按照《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）要求，采用本方法檢測樣品中吡蟲啉的含量，檢測結果應表示為（4.54±0.24）μg·kg-1。

3 結論

采用液相色譜-串聯質譜法測定水果中吡蟲啉含量，對整個操作過程中存在的不確定度分量進行系統評定。通過評定可以看出，液相色譜-串聯質譜法進行水果中吡蟲啉檢測，基質標準溶液的配制引入的不確定度貢獻最大，回收率和樣品稱量引入的不確定度貢獻次之。因此，今后的工作中，標準系列溶液配制時應通過更合理地設置標準曲線濃度，選用合適的移液工具，嚴格控制實驗室的溫度，提高檢測人員的技術水平，切實減小不確定度分量，保證檢測數據的科學性和合理性。