液相色譜-原子熒光聯用法測定沙丁魚罐頭中甲基汞含量的不確定度評定

◎ 郭倩倩，李 新，康雪梅，李夢雨，賈松濤，李 超，趙雪峰，趙林萍

（1.河南中標檢測服務有限公司，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學，河南 鄭州 450000）

汞是一種對環境和人體有害的重金屬，隨著食物鏈傳遞和富集，在水生系統中尤其嚴重。MOHAN等人[1]發現汞的積累潛力沿著食物鏈增加，在魚類組織中有較高的汞濃度。朱文慧等人[2]發現魚體內汞含量可能較生活環境中的汞含量高100萬倍。

汞以多種形態廣泛存在于環境中，其中甲基汞是具有較強生物有效性和毒性的有機汞形態，在所有汞化合物中毒性最強[3]，在我國各種環境介質和生物體組織中都檢測到了甲基汞的存在[4]。甲基汞具有高神經毒性、致癌性，且在生物體中造成累積和放大效應，可對人類及食魚生物的健康造成嚴重影響[5]，PRINCE等人[6]發現甲基汞暴露選擇性地靶向腦和小腦皮質，導致神經元發育不良，蘇海磊等人[7]發現甲基汞可以對脊椎動物造成神經蘇醒、內分泌干擾和生殖毒性等。有研究數據表明，通過食物鏈的傳遞作用，魚類等水生生物可以將水體中ng·L-1級甲基汞富集達10～20萬倍[8]。對此，中國、歐盟、美國、日本、韓國及澳大利亞等均對水產品中甲基汞含量做了限制，且中國對甲基汞的限量要求相對偏嚴[9]，因此要求檢測人員準確測定水產食品中的甲基汞含量。

本文選取基質較為復雜的沙丁魚罐頭作為研究對象，依據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[10]和《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006：2019）[11]，對《食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定》（GB 5009.17—2014）第二篇中甲基汞測定不確定度進行分析和評定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-原子熒光聯用儀（北京吉天SA20）；高速臺式冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；振蕩器（德國IKA）；電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；玻璃量器（北京玻璃廠）。

甲基汞溶液標準物質（65.0 μg·g-1，中國計量科學研究院）；硝酸（優級純，蘇州晶瑞）；甲醇（色譜純）；鹽酸（優級純）；其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

根據《食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定》（GB 5009.17—2014）第二篇液相色譜-原子熒光光譜聯用法，進行測定。

1.2.1 樣品前處理

準確稱取樣品1.0 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入5 mol·L-1的鹽酸溶液10 mL，放置過夜。室溫下超聲水浴提取60 min，期間數次震搖。4 ℃下以8 000 r·min-1轉速離心15 min。準確吸取2.0 mL上清液至5 mL容量瓶中，逐滴加入6 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，使pH為2～7。加入10 g·L-1的L-半胱氨酸0.1 mL，最后用水定容至刻度。用0.45 μm有機系濾膜過濾，上機進行檢測。

1.2.2 標準溶液的配制

準確稱取甲基汞溶液標準物質0.384 6 g，用純水定容至25 mL容量瓶中，搖勻，得到甲基汞標準儲備液1 μg·mL-1。用10 mL單標線移液管準確量取10 mL甲基汞標準儲備液至100 mL容量瓶中，得到100 μg·L-1甲基汞中間工作液；分別用移液管移取0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL至25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，分別得到濃度為0 μg·L-1、1 μg·L-1、2 μg·L-1、4 μg·L-1、6 μg·L-1、8 μg·L-1和10 μg·L-1的標準溶液。

1.2.3 儀器條件

（1）液相色譜。色譜柱：C18色譜柱（柱長150 mm，內徑4.6 mm）；流動相：5%甲醇+0.06 mol·L-1乙酸銨+0.1% L-半胱氨酸；流動相洗脫方式：等度洗脫；流動相流速：1.0 mL·min-1；進樣體積，100 μL。

（2）原子熒光光度計。負高壓：300 V；燈電流：30 mA；載氣流速：400 mL·min-1；輔助氣流速：400 mL·min-1；載流：10%鹽酸溶液；還原劑：2 g·L-1KHB4；氧化劑，2 g·L-1過硫酸鉀。

2 結果與分析

2.1 不確定度評定數學模型的建立

根據甲基汞含量計算公式以及測量不確定度的主要影響因素，建立沙丁魚罐頭中甲基汞含量的不確定度評定數學模型（1）：

式（1）中，X為試樣中甲基汞的含量，mg·kg-1；C為經標準曲線得到的測定液中甲基汞的濃度，μg·L-1；C0為經標準曲線得到的空白溶液中甲基汞的濃度，μg·L-1；V為加入提取試劑的體積，mL；m為試樣稱樣量，g；f為稀釋因子；1 000為換算系數。

2.2 不確定度來源與分析

從樣品前處理過程、測量過程和數學模型分析，用液相色譜-原子熒光聯用法測定沙丁魚罐頭中甲基汞不確定度來源，主要有以下幾個方面：樣品測量重復性引入的不確定度、樣品稱量引入的不確定度、樣品前處理及定容過程引入的不確定度、標準物質及配制引入的不確定度、標準曲線擬合引入的不確定度。

2.2.1 樣品測量重復性引入的相對標準不確定度urel(rep)

在重復性條件下，對同一樣本重復測量10次，測得樣品中甲基汞的含量分別為0.17 mg·kg-1、0.17 mg·kg-1、0.18 mg·kg-1、0.19 mg·kg-1、0.16 mg·kg-1、0.18 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.17 mg·kg-1、0.18 mg·kg-1和0.20 mg·kg-1，其平均值為0.18 mg·kg-1。

測量重復性以標準偏差表示，10次測量的標準偏差按貝塞爾公式計算為：

以兩次測量的平均值作為最終測定結果，則本次測量的標準偏差為：

本次測定兩個結果分別為X1=0.18 mg·kg-1，X2=0.19 mg·kg-1，其平均值為0.18 mg·kg-1，則測量重復性引入的相對標準不確定度為：

2.2.2 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(m)

根據萬分之一電子天平校準證書，其最大允許誤差為±0.000 5 g，稱量兩次，第1次空燒杯，第2次空燒杯加樣品，因為每一次稱量均為獨立的觀測結果，兩者的現行影響間是不相關的[11]。按照矩形分布其標準不確定度為：

根據方法要求，稱取混合均勻的樣品1.0 g，則樣品稱量引入的相對標準不確定度為：

2.2.3 樣品前處理及定容過程引入的相對標準不確定度urel(V)

樣品前處理及定容過程中不確定度由玻璃量器引入。根據《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[12]要求的容量允差，假設其為矩形分布則可計算各量器由體積引入的標準不確定度u(a)，u(a)=容量允差由實驗室溫度在（20±5）℃，得ΔT=5 ℃，水在20 ℃的膨脹系數為2.1×10-4℃-1，按照矩形分布計算溫度引入的標準不確定度u(b)，結 合 體 積 和 溫度引入的不確定度，各玻璃量器引入的標準不確定度為，其相對標準不確定度為樣品前處理及定容過程，玻璃量器引入的不確定度具體計算見表1。

表1 樣品前處理及定容過程玻璃量器引入的不確定度表

樣品前處理及定容過程中，10 mL分度移液管、2 mL分度移液管、5 mL容量瓶各用到一次，綜上計算，則相對標準不確定度為：

2.2.4 標準物質及配制引入的相對標準不確定度urel(c)

由標準物質及配制引入的不確定度主要包括：標準物質純度引入的不確定度、標準儲備液配制引入的不確定度（包括標準物質稱量及標準物質定容）、標準中間工作液配制引入的不確定度以及標準曲線系列配制過程中引入的不確定度。

（1）標準物質純度引入的相對標準不確定度urel(c1)。甲基汞標準物質證書給出的濃度為（65.0±2.5）μg·g-1，k=2，則標準不確定度為：相對標準不確定度為

（2）標準儲備液配制引入的相對標準不確定度urel(c2)。①標準物質稱量引入的相對標準不確定度urel(c′2)。根據十萬分之一天平校準證書，其最大允許誤差為±0.5 mg，按照均勻分布則標準不確定度為：

稱取標準物質0.384 6 g，則產生的相對標準不確定度為：

②標準物質定容引入的相對標準不確定度urel(c′2)。標準物質定容引入的不確定度由單標線容量瓶的容量允差帶入。按矩形分布其相對標準不確定度計算見表2。

表2 標準物質定容過程玻璃量器引入的不確定度表

則由標準儲備液配制引入的相對標準不確定度為：

（3）標準中間工作液配制引入的相對標準不確定度urel(c3)。標準中間工作液配制引入的不確定度由移液管和容量瓶的容量允差帶入，假設其為矩形分布其相對標準不確定度計算見表3。

表3 標準中間工作液配制過程玻璃量器引入的不確定度表

則標準中間工作液配制引入的相對標準不確定度為：

（4）標準曲線配制過程中引入的相對標準不確定度urel(c4)。標準曲線配制引入的不確定度由容量瓶和移液管容量允差帶入，假設其為矩形分布則標準曲線配制過程中25 mL容量瓶引入的不確定度計算同表2，其相對標準不確定度為0.000 92，分度移液管引入的不確定度計算見表4。

表4 標準曲線配制過程分度移液管引入的不確定度表

在甲基汞標準溶液配制過程中，25 mL容量瓶用到7次，則標準曲線配制過程中引入的相對標準不確定度為：

由此得出標準物質及配制引入的相對標準不確定度為：

2.2.5 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(q)

標準曲線是采用最小二乘法對甲基汞標準溶液濃度X與其對應的峰面積Y進行線性回歸，得到甲基汞標準曲線Y=bX+a，本實驗對7個濃度水平的標準工作液分別重復3次測定，根據其平均值擬合所得標準曲線為Y=10 882X-891.2（R2=0.999 0），標準溶液濃度與峰面積見表5。

表5 標準曲線的測定結果表

標準曲線標準差計算公式為：

標準曲線擬合引入的標準不確定度計算公式為：

其中Ai為建立工作曲線用標準系列溶液中甲基汞的質量濃度對應的峰面積；b為擬合曲線的斜率，b=10 882；a為擬合曲線的截距，a=-891.2；n為標準溶液總測試次數，n=21；p為樣品的測試次數，p=2；c0為實測樣品的平均測試濃度，c0=7.505 7 μg·L-1；ci為標準溶液各校準點的濃度，μg·L-1；為標準曲線各校準點的平均濃度，c-=4.428 6 μg·L-1；i為濃度水平序號。

在不確定度的評定過程中，本次實驗對樣品進行兩次測定，平均測試濃度為c0=7.505 7 μg·L-1，從上述數據和公式，可得S=720.92，u(q)=0.054 μg·L-1。

標準曲線的擬合引入的相對標準不確定度為：

2.3 合成不確定度

各個相對標準不確定度分量及量值，匯總見表6。

表6 各個相對標準不確定度來源分量及量值表

對表中各分量進行合成，得到合成相對標準不確定度為：

本次實驗，沙丁魚罐頭中甲基汞含量測定的平均值為0.18 mg·kg-1，則合成標準不確定度為：

2.4 擴展不確定度及不確定度結果報告

在95%的置信區間下，取包含因子k=2，擴展不確定度為U(X)=k×u(X)=0.022 mg·kg-1。

沙丁魚罐頭中甲基汞含量結果表示為（0.18±0.03）mg·kg-1。

3 結論

按照GB 5009.17—2014的檢測方法，對液相色譜-原子熒光聯用儀測定丁魚罐頭中甲基汞含量進行不確定度分析，不確定度結果表示為：X=（0.18±0.03）mg·kg-1，k=2。

從不確定度評定過程來看，影響實驗最終結果的因素主要有樣品測量的重復性、標準物質及配制、標準曲線的擬合，這就要求檢測人員在今后的檢測工作中，增加平行樣的檢測頻次、使用精度較高的計量器具、規范操作要求等，以降低不確定度帶來的影響，提高數據的準確性，為保障食品安全提供強有力的數據支撐，為食品安全保駕護航。