慢性乙型病毒性肝炎患者維生素D及其受體表達與炎癥損傷程度及肝細胞癌發生的相關性分析

李玉苓 鄒東花 譚艷 張衛民 孫韜

我國是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染高發國家，HBV感染造成肝臟反復損傷和修復可導致慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）、肝硬化、肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）發生［1-2］。近年研究證實，維生素D（Vitamin D，VitD）具有抑制細胞增殖、調節機體免疫、抑制腫瘤浸潤和轉移等作用［3-4］。VitD 生物學效應主要由細胞內特異性VitD 受體（Vitamin D receptor，VDR）介導，肝癌細胞可能是VitD 和VDR 作用的靶細胞［5］。HBV 導致CHB、HCC的發病機制尚未完全闡明，目前認為，HBV 通過誘導機體免疫反應，分泌多種炎性細胞因子，導致肝臟炎癥表現［6-7］?；诖?，本研究嘗試分析CHB 患者VitD及其受體表達與炎癥損傷程度及HCC 發生的相關性，為HCC防治提供理論依據。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月至2020年6月滄州市傳染病醫院中西醫結合肝病科102 例CHB 患者作為研究對象，根據其是否發生HCC 分為HCC 組20 例、非HCC 組82 例。納入標準：均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》［8］中CHB 診斷標準；HCC組均符合《原發性肝癌診療規范（2017年版）》［9］中HCC 診斷標準；臨床治療需要進行肝穿刺活檢；患者及家屬知情同意。排除標準：伴酒精性肝病、藥物性肝損傷、心血管疾病、自身免疫性疾??；合并甲型、丙型、丁型、戊型肝炎病毒及EB 病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）、巨細胞病毒（CytoMegalo Virus，CMV）、人類免疫缺陷病毒（AcquiredImmune Deficiency Syndrome，AIDS，HIV）感染；惡性腫瘤。本研究經我院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

①肝組織VDR、VDRmRNA、VDR 蛋白檢測：進行超聲引導下肝活檢，采用Power Vision TM 二步免疫組化法檢測VDR 表達，顯微鏡下觀察結果，細胞呈棕黃色為陽性。采用實時熒光定量PCR 法測定VDRmRNA：提取肝組織總RNA（美國Invitrogen 公司Trizol 試劑），逆轉錄合成cDNA，Taq DNA聚合酶作用下合成PCR 產物，PCR 反應參數：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個循環，根據待測基因與管家基因的Ct 值，VDRmRNA相對水平用RQ 值（2-ΔΔCt）表示。采用Western blot 法檢測VDR 蛋白，艾菲生物技術有限公司兔抗人VDR 多克隆抗體，美國Bioworld公司抗GAPDH 抗體，提取肝組織蛋白，電泳、轉膜、封閉，加一抗、二抗，行化學發光反應、曝光、顯影，掃描圖片，計算VDR 蛋白與GAPDH 灰度比值。②血清VitD、IL-6、Hs-CRP、TNF-α 檢測：采集靜脈血5 mL，離心（15 min，半徑8 cm，轉速3 500 r/min），取血清，VitD 采用瑞士羅氏全自動電化學發光分析儀Cobas e602 檢測；IL-6、Hs-CRP、TNF-α以酶聯免疫法檢測，武漢新啟迪生物科技有限公司試劑盒。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 22.0 處理數據，計數資料以n（%）描述，行χ2檢驗。計量資料以（）描述，兩組間用t檢驗；影響因素采用Logistic 回歸分析；雙變量正態分布采用Pearson 分析相關性；預測價值采用受試者工作特征（ROC）曲線，聯合預測實施Logistic 二元回歸擬合，返回預測概率logit（p），將其作為獨立檢驗變量。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料、VitD、VDR 表達等比較

兩組年齡、吸煙、飲酒、HBV DNA、IL-6、Hs-CRP、TNF-α、VitD、VDRmRNA 及蛋白表達相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組臨床資料、VitD、VDR 表達比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data，VitD and VDR expression between 2 groups［n（%），（±s）］

表1 兩組臨床資料、VitD、VDR 表達比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data，VitD and VDR expression between 2 groups［n（%），（±s）］

指標性別男女年齡＜45 歲≥45 歲體質量指數＜23 kg/m2≥23 kg/m2吸煙是否飲酒是否HBV DNA（log10 IU/mL）ALT（IU/L）AST（IU/L）GGT（IU/L）TBIL（μmmol/L）IL-6（ng/l）Hs-CRP（mg/L）TNF-α（μg/L）VitD（ng/ml）VDR mRNA VDR 蛋白HCC 組（n=20）15（75.00）5（25.00）6（30.00）14（70.00）9（45.00）11（55.00）9（45.00）11（55.00）8（40.00）12（60.00）5.87±1.22 60.14±10.23 39.63±5.69 35.41±5.14 14.78±3.25 104.35±30.26 15.47±5.06 1.56±0.31 40.58±9.32 2.74±0.32 1.16±0.39非HCC 組（n=82）62（75.61）20（24.39）47（57.32）35（42.68）37（45.12）45（54.88）15（18.29）67（81.71）11（13.41）71（86.59）4.85±0.97 57.25±9.84 37.14±5.12 33.94±4.83 14.21±2.98 68.41±23.59 10.23±4.15 1.12±0.25 65.41±12.48 1.69±0.22 0.78±0.42 χ2/t 值0.054 4.807 0.000 6.374 5.846 4.001 1.169 1.908 1.205 0.754 5.766 4.844 6.722 8.336 17.384 3.676 P 值0.816 0.028 0.992 0.012 0.016＜0.001 0.245 0.059 0.231 0.453＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 CHB 患者HCC 發生影響因素

Logistic 回歸分析年齡、吸煙、飲酒、HBV DNA、IL-6、Hs-CRP、TNF-α、VitD、VDRmRNA 及蛋白表達均為CHB 患者HCC 發生影響因素（P＜0.05）。見表2。

表2 CHB 患者HCC 發生影響因素Table 2 Influencing factors of HCC in CHB patients

2.3 VitD、VDR 表達與炎癥損傷程度的關系

Pearson 相關性可知，CHB 患者VitD 表達與炎癥損傷程度指標IL-6、Hs-CRP、TNF-α 均呈負相關關系，VDRmRNA 及蛋白表達與炎癥損傷程度指標IL-6、Hs-CRP、TNF-α呈正相關關系（P＜0.05）。見表3。

表3 VitD、VDR 表達與炎癥損傷程度的關系Table 3 The relationship between the expression of VitD and VDR and the degree of inflammatory injury

2.4 VitD、VDR 表達對CHB 患者HCC 發生的預測價值

繪制ROC 曲線，評價VitD、VDR 表達對CHB患者HCC 發生的預測價值，發現VitD、VDRmRNA 及蛋白表達聯合預測AUC 最大，且＞0.9，具有較高預測效能。見表4，圖1。

表4 VitD、VDR 表達對CHB 患者HCC 發生的預測價值Table 4 The predictive value of VitD and VDR expression in the occurrence of HCC in CHB patients

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curve

3 討論

HCC 是目前世界第五大常見腫瘤，位列癌癥死亡原因第二位，其中70%與CHB 有關［10］。腫瘤形成是復雜的多因素作用過程，近年來，VitD 抗腫瘤作用日益受到重視。汪玲妹等［11］研究顯示，VitD 可上調VDR 表達，增強IFN-JAK-STAT 信號途徑，與IFN-α 協同發揮抗HBV 效應，而CHB 患者存在VitD/VDR 信號通路功能降低。由此可知，VitD 及VDR 表達可能在HCC 發生、發展中發揮重要作用，探討其相關機制具有重要臨床價值。

VitD 生物學效應主要由VDR 介導，VDR 分為膜受體（mVDR）和核受體（nVDR）。mVDR 主要維持鈣磷平衡，而nVDR 本質是配體依賴的核轉錄因子，調節組織細胞增殖分化及其相應生物學功能。VitD 抗腫瘤作用主要通過與nVDR 結合實現。既往研究證實，VitD 可上調多種組織細胞VDR 蛋白表達，但對VDRmRNA 水平的調節存在明顯組織細胞特異性［12］。VDR 廣泛分布于機體各組織細胞中，VDR 在結腸癌［13］、乳腺癌［14］等癌組織中表達的研究發現，癌組織VDR 表達明顯低于正常粘膜組織，且VDR 均表達于細胞核內。目前，已有研究在多種肝癌細胞系中發現VDR 表達［15-16］。提示VDR基因可能是肝癌易感基因，肝癌細胞可能是VitD 和VDR靶細胞。李玉苓等［17］研究顯示，HCC 組織VDRmRNA 及VDR 蛋白表達量顯著高于癌旁肝硬化組織、正常肝臟組織。通過實時熒光定量PCR 檢測顯示VitD、VDRmRNA 及蛋白表達均為CHB 患者HCC 發生影響因素。HCC 患者體內存在VitD/VDR 信號通路功能降低，與HCC 發生密切相關，這可能不利于藥物發揮抗病毒作用，甚至加速HCC 進展。本研究還提示，HCC 及CHB 患者VitD 水平越低，VDRmRNA及蛋白表達越高，可能存在反饋調節關系。另外，腫瘤發生導致VDR 升高，還是VDR升高誘導腫瘤發生，尚需進一步研究。

CHB 患者肝功能損害并非由CHV 直接損害肝細胞所致，其發生、發展與患者細胞免疫功能關系緊密［18］。本研究發現，CHB 患者VitD 表達與炎癥損傷程度指標IL-6、Hs-CRP、TNF-α 均呈負相關關系，VDRmRNA 及蛋白表達與炎癥損傷程度指標IL-6、Hs-CRP、TNF-α 呈正相關關系。推測VitD/VDR 信號通路功能降低可能通過促進肝臟炎癥性表現，加速CHB 向肝硬化及HCC 進展。本研究首次評價VitD、VDR 表達對CHB 患者HCC 發生的預測價值，ROC 曲線顯示，VitD≤52.97 ng/mL、VDRmRNA＞2.13、VDR 蛋白＞1 時，均 高度懷疑HCC 發生，各指標聯合預測AUC 達0.958，高于單獨預測。因此，臨床可同時檢測VitD、VDRmRNA、VDR 蛋白，為CHB 患者HCC 發生預測提供更全面、有效的參考信息。

綜上可知，CHB 患者VitD 與VDR 表達與炎癥損傷程度有關，且可能參與HCC 發生發展過程，對HCC 發生具有較高預測價值。