組織蛋白酶B響應的超極化129Xe MRI探針對肺癌細胞的超靈敏探測

王崇武，黃 曦，石 磊，陳世楨，周 欣

組織蛋白酶B響應的超極化129Xe MRI探針對肺癌細胞的超靈敏探測

王崇武1,2#，黃 曦1#，石 磊1，陳世楨1，周 欣1*

1. 波譜與原子分子物理國家重點實驗室，武漢磁共振中心（中國科學院精密測量科學與技術創新研究院，中國科學院武漢物理與數學研究所），湖北 武漢 430071；2. 中國科學院大學，北京 100049

組織蛋白酶B（Cat B）是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，在細胞代謝中起重要作用．已有研究表明Cat B在肺癌細胞中會過表達．因此，細胞內Cat B水平的檢測非常重要．迄今為止，細胞內Cat B的檢測方法主要為熒光成像，但該技術受限于滲透性和自發熒光背景干擾．為了解決這些問題，我們設計了一種基于超極化129Xe磁共振成像的新型探針．它由一個作為129Xe 核磁共振（NMR）報告基團的穴番分子籠和一個作為Cat B特異性可裂解基團的酰胺鍵組成．當探針與Cat B相互作用時，酰胺鍵的斷裂會導致其129Xe化學位移發生變化．結合超極化-化學交換飽和轉移（Hyper-CEST）技術，可為Cat B提供一種新穎的檢測方法．

核磁共振（NMR）；造影劑；肺癌；超極化129Xe MRI探針；組織蛋白酶B，化學交換飽和轉移（CEST）

引 言

組織蛋白酶B（Cat B）在腫瘤的生長、遷移、侵襲和轉移中起著至關重要的作用[1]，關于實體瘤的一些報道表明，Cat B表達與腫瘤發展進程之間存在相關性[2]，這一特點使得Cat B可以用作生物標志物，成為癌癥診斷和治療的靶標．迄今為止，已有許多研究[3-5]對Cat B進行了檢測，且大多數方法集中于光學成像．然而，較差的穿透能力和自發熒光背景限制了該技術的應用．

磁共振成像（MRI）具有高的空間分辨率和深層的組織穿透能力，在疾病臨床診斷方面享有獨特的優勢．然而，傳統的質子MRI信號具有靈敏度低和背景干擾強等缺點[6,7]．為解決這一問題，伴隨著自旋交換光泵技術[8-12]的發展，超極化129Xe MRI分子探針開始實用化．129Xe是一種無毒的惰性氣體，可溶于血液，其化學位移對周圍環境（pH、溫度、酶等）非常敏感，這些特性使129Xe非常適合生物醫學成像．129Xe可以在“分子籠”的幫助下與蛋白質、磷脂等相互作用．目前，一系列新的分子籠[13]已被開發．其中，穴番-A及其衍生物是最合適的129Xe結合分子籠[14]，因為它們與129Xe的親和力最佳．近年來，已開發出大量基于穴番-A的129Xe生物傳感器，用于檢測金屬離子[15-17]、硫醇[18,19]、pH[20,21]、酶[22,23]、硫化氫[24]、核酸[25]、跨膜受體靶標[26-30]、蛋白質[31-33]等．與傳統的熱極化相比，新的超極化129Xe技術可以使129Xe的極化增強10萬倍以上，大大提高MRI信號的檢測靈敏度．但是，超極化129Xe MRI探針的靈敏度仍然不足以支持體內相關分子的檢測．為此，結合了超極化129Xe和化學交換飽和轉移的Hyper-CEST技術被開發出來，以進一步提高129Xe分子探針的檢測靈敏度．Hyper-CEST使用交換進出超分子籠的129Xe和施加的預飽和脈沖來減少在129Xe溶解狀態下觀察到的信號．

本文設計了一種新型的將高靈敏度的129Xe Hyper-CEST與特定刺激響應相結合的穴番-A功能化分子探針a，由129Xe 核磁共振（NMR）報告基團的穴番分子籠和對Cat B特異性相應的酰胺鍵組成．Cat B已被證實在非小細胞肺癌中過表達[34]，當探針與非小細胞肺癌A549相互作用時，酰胺鍵的斷裂會導致其129Xe化學位移發生變化．結合Hyper-CEST技術，可為Cat B提供一種新穎的檢測方法．

1 實驗部分

1.1 試劑

Cat B、N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）和三氟乙酸（TFA）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；N-Boc-溴乙胺、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸（EDCI）、Val-Lys-PABA-PNP和L-半胱氨酸（L-Cys）購自阿拉丁生化技術有限公司；碳酸鉀、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、鹽酸、碳酸氫鈉、氯化鈉、甲醇和EDTA-2Na購自國藥集團化學試劑有限公司；Cat B抑制劑CA-074 Me購自MCE；穴番-A購自武漢利普爾森科技有限公司；人肺腺癌細胞系A549和人胚肺成纖維細胞系MRC-5獲自中國科學院細胞庫（中國上海）．除非另有說明，否則所有試劑未經進一步純化直接使用．

1.2 探針a的合成

化合物2的合成．將穴番-A（化合物1，50 mg，0.057 mmol）和N-Boc-溴乙胺（100 mg，0.476 mmol）溶于25 mL丙酮中．向溶液中加入碳酸鉀（100 mg，0.725 mmol），在回流條件下反應12 h．使用旋轉蒸發儀除去丙酮，并將乙酸乙酯和水加入到殘余固體中．有機層用水洗滌3次，然后旋干．使用硅膠柱色譜法，利用正己烷:乙酸乙酯＝1:1的洗脫液純化粗產物，得到白色固體狀的化合物2（47 mg，產率為80%）．1H NMR譜圖（500 MHz，CDCl3）：6.80～6.65（m，12H），4.59（m，6H），4.23～4.10（m，12H），4.03（m，1H），3.87（m，1H），3.83～3.75（m，15H），3.65（m，1H），3.40（m，7H），1.53（s，9H）．高分辨質譜[HRMS，采用電噴霧離子源（ESI）]：[M+K]+質荷比（/）的計算值為1 062.404 2，實驗值為1 062.404 9．

化合物3的合成．冰浴條件下，滴加TFA:CH2Cl2＝1:1的混合溶液（20 mL）至47 mg化合物2．反應15 min后，將TFA和CH2Cl2通過旋蒸除去，得到化合物3（產率為93%）．HRMS（ESI）：[M-CF3COO]-的/計算值為924.395 9，實驗值為924.408 3．

化合物4的合成．將中間體化合物3溶解在再蒸餾的CH2Cl2（25 mL）中，并加入0.5 mL DIPEA．攪拌10 min后，向溶液中添加Val-Lys-PABA-PNP二肽衍生物（40 mg，0.053 mmol），室溫條件下，攪拌反應16 h．然后向溶液中加入20 mL CH2Cl2，依次用30 mL 0.1 mol/L HCl、飽和NaHCO3、飽和NaCl洗滌．干燥后，將殘余物使用硅膠柱色譜純化，洗脫劑溶劑為CH2Cl2:MeOH＝20:1（/），得到淺黃色固體，即化合物4（29 mg，產率為42%）．

探針a的合成．冰浴條件下，將TFA:CH2Cl2＝1:1的混合溶液滴加到化合物4中．反應15 min后，通過旋轉蒸發儀除去TFA和CH2Cl2，得到探針a（25 mg，產率為85%）．HRMS（ESI）：[M+Na]+的/計算值為1 456.625 7，實驗值為1 456.625 1．

合成過程和反應機理如圖1所示．首先對穴番進行氨基衍生化，然后通過酰胺鍵將穴番與Z-Val-Lys的衍生物Val-Lys-PABA-PNP連接。該探針的酰胺鍵可被Cat B特異性酶切，隨后進一步重排、離去生成穴番的氨基衍生物．

圖1 穴番探針a的(a)合成路線和(b)反應機理

1.3 溶液129Xe Hyper-CEST實驗

向10 mmol/L乙酸鈉的緩沖液（pH 5.0，含2 mmol/L EDTA-2Na、2 mmol/L L-Cys和0.1% DMSO）中加入不同濃度的探針a，配置成不同濃度的探針溶液，使用的Cat B含量為1 UN/mL，使用的Cat B抑制劑CA-074 Me濃度為10 μmol/L．

溶液129Xe Hyper-CEST測試在配備微成像梯度線圈的Bruker AV400寬口徑波譜儀（Bruker Biospin，Ettlingen，Germany）上進行．Xe核的射頻脈沖頻率為110.7 MHz．具有90?翻轉角矩形脈沖的10 mm雙諧振探頭（129Xe和1H，PA BBO 400 W1/S2 BB-HD-10Z）用于采集129Xe NMR信號. 使用課題組自制超極化裝置，通過自旋交換光泵法來制備超極化129Xe氣體，129Xe核自旋極化度約為20%．

進行溶液129Xe Hyper-CEST實驗時，將2 mL溶液樣品裝入10 mm NMR樣品管中，通入由10% N2、88% He和2% Xe（86%富集的129Xe或天然豐度129Xe）組成的混合氣體，持續20 s，然后等待3 s以確保產生的氣泡完全破裂，再開始采集129Xe NMR信號．樣品溫度設定為300 K，由變溫單元控制．Xe位于50～100 ppm之間，步長為5 ppm．飽和照射功率為6.5 μT，照射時間為10 s．

使用快速采集弛豫增強（RARE）序列采集磁共振圖像，成像視野（FOV）=2×2 cm2、matrix size=32×32、slice thickness=30 mm、echo time=6 ms、repetition time=99.3 ms、rare factor=16．129Xe磁共振圖像使用0.2*最大值作為閾值進行分割，然后插值到64×64矩陣中．

1.4 細胞129Xe Hyper-CEST實驗

實驗組樣品制備：將A549細胞在25 cm2培養瓶中培養到大約90%的面積（5×106細胞）．棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，加入2 mL含10 μmol/L（或其他濃度）探針a的MEM培養基（含1% DMSO）；在培養箱中孵育6 h后，吸出培養基，用PBS沖洗3次細胞后，使用細胞刮刀將其收集在2 mL PBS中，以3 000 rpm離心2 min后，棄去上清液，將細胞分散在2 mL PBS中．

對照組A樣品制備：其他條件與實驗組相同，但在與探針a溶液（10 μmol/L）孵育前，將細胞用2 mL含50 μmol/L Cat B抑制劑CA-074 Me的MEM培養基（含1% DMSO）預處理1 h，并除去未吸收的CA-074 Me．然后進行后續實驗．

對照組B樣品制備：其他條件與實驗組相同，但使用MRC-5細胞與含有10 μmol/L探針a的MEM培養基孵育．

空白組樣品制備：其他條件與實驗組相同，但未添加探針a溶液．

對上述樣品進行細胞129Xe Hyper-CEST實驗及磁共振圖像采集，測試飽和照射功率為13 μT，其他方法及參數與溶液129Xe Hyper-CEST實驗時相同．

1.5 細胞毒性檢測實驗

我們采用甲基四唑藍（MTT）法檢測探針a的細胞毒性，將A549細胞接種在96孔板中，細胞密度為5×104細胞/孔，培養過夜讓細胞貼壁生長，棄去舊培養基，并添加200 μL設定濃度梯度（0、1、5、10、20、50、100 μmol/L）的探針a溶液（探針a溶于MEM培養基中，含1% DMSO），探針a終濃度以在490 nm波長下的吸光度確定．細胞與探針孵育4 h后，吸出培養基，用無菌PBS洗3遍；再加入新鮮全培養基，繼續孵育44 h，接著加入MTT溶液至終濃度為0.5 mg/mL，繼續孵育4 h；然后吸出培養基，加入200 μL DMSO，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞不具備此功能．DMSO能溶解細胞中的結晶甲臜，將DMSO震蕩均勻后，用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量．

2 結果與討論

2.1 溶液129Xe Hyper-CEST研究

探針a是一個可以裝載129Xe的分子籠，籠內的129Xe將與溶液中的129Xe發生交換．其結構中的酰胺鍵可被Cat B特異性剪切，導致分子籠的結構和性能發生變化．利用129Xe對化學環境的敏感性，獲得超極化129Xe CEST信號，用于Cat B的超靈敏檢測．

我們首先比較了探針a與Cat B反應前后（37 ℃，24 h）的Hyper-CEST信號，選擇的飽和照射頻率（RF）位點為60～80 ppm，每兩點之間的間隔為1 ppm，并收集300 ppm的信號以對數據進行歸一化．如圖2所示，濃度為2 μmol/L的探針a與Cat B反應前無CEST信號；與Cat B反應后，在68 ppm處出現非常明顯的CEST信號．濃度為5 μmol/L的探針a反應前在70 ppm處具有相對較小的信號；反應后在68 ppm處具有非常明顯的CEST信號．可以證明與Cat B反應前后，探針a的信號強度和化學位移存在差異，這表明它作為Cat B反應探針的可行性，并且CEST信號強度隨探針濃度的增加而增加．

圖2 (a) 2 μmol/L和(b) 5 μmol/L的探針a與Cat B反應前后的129Xe Hyper-CEST信號

為驗證該探針的特異性，我們添加了Cat B特異性抑制劑CA-074 Me，并保持溶液中其他成分濃度不變（探針a濃度為5 μmol/L）．如圖3所示，加入抑制劑后的探針a和Cat B混合溶液的CEST信號與僅含探針a的溶液類似，而未加抑制劑的探針a和Cat B混合溶液在68 ppm處出現一個明顯的CEST信號．這證明探針a對Cat B具有特異性響應，并且該響應可以被Cat B特異性抑制劑抑制．

2.2 細胞129Xe Hyper-CEST研究

為了驗證細胞水平下探針a對Cat B的響應，我們檢測到探針a與A549細胞孵育后的Hyper-CEST信號位于78 ppm處（圖4），且CEST信號強度隨探針a濃度的增加而增強．與溶液體系中探針a與Cat B反應后的信號出現在68 ppm不同，細胞體系中出現在78 ppm．這可能是因為復雜的細胞體系影響了129Xe在籠內籠外的交換速率，從而使得化學位移發生偏離．

圖3 抑制劑CA-074 Me對探針a和Cat B相互作用的影響

圖4 不同濃度的探針a與A549細胞孵育后的Hyper-CEST信號

使用Cat B特異性抑制劑CA-074 Me預處理A549細胞，然后與探針a進行孵育．如圖5所示，加入抑制劑后，仍然可以檢測到Hyper-CEST信號，但是強度遠低于沒有添加抑制劑時，這說明A549細胞中含有Cat B，并證明了探針a能特異性響應Cat B．將探針a分別與MRC-5與A549細胞孵育，檢測Hyper-CEST信號．如圖6所示，從A549細胞變為正常MRC-5細胞后，未檢測到Hyper-CEST信號，證明了探針a對Cat B過表達的A549細胞的特異性識別能力．

圖5 抑制劑CA-074 Me對探針a和A549細胞相互作用的影響

圖6 MRC-5與A549細胞分別與探針a孵育的Hyper-CEST信號

2.3 129Xe Hyper-CEST MRI效果

從圖7中可以看出，5 μmol/L探針a與低濃度的Cat B反應時，具有一定的Hyper-CEST成像效果（27.78%）；當添加Cat B特異性抑制劑時，Hyper-CEST成像效果幾乎消失，僅為0.5%；而空白溶液中沒有此效果（-2.33%），這證明Hyper-CEST成像效果是由于探針a與Cat B的反應所致．將探針a的濃度增加至15 μmol/ L后，Hyper-CEST成像效果明顯增強，達到62.98%．而且通過探針a和Cat B的反應，我們可以獲得高對比度的圖像．這證明我們設計的探針a可實現低濃度Cat B的Hyper-CEST成像．

圖7 (a) 溶液129XeHyper-CEST MRI和(b) CEST效果

從圖8中可以看出，高濃度（25 μmol/L）探針a與A549細胞共孵育具有較好的Hyper-CEST成像效果，達到52.25%．當添加Cat B抑制劑時，成像效果顯著降低至13.83%．沒有探針（空白對照）的A549細胞沒有CEST效應（-0.5%），這證明該效應源自探針a與A549細胞的反應．而探針a與MRC-5細胞孵育的Hyper-CEST成像效果也很差（7.76%），證實該探針具有特異性檢測肺癌細胞的潛力．

圖8 (a) 細胞129Xe Hyper-CEST成像和(b) CEST效果

2.4 探針a的細胞毒性檢測

圖9顯示了采用MTT法檢測的探針a的細胞毒性，表明即使使用濃度高達100 μmol/L的探針a，A549細胞存活率仍可以大于80%，這證明該探針具有良好的生物相容性．前面實驗使用的探針濃度最高為30 μmol/L，因此對A549細胞不會產生明顯的細胞毒性，這證明該探針適用于MRI測試．

圖9 探針a對A549細胞的毒性測試

3 結論

我們合成了一種新型的超靈敏的穴番衍生物129Xe探針，該探針由穴番和Cat B響應的二肽組成，并成功用于獲得溶液和細胞的CEST NMR譜，而且靈敏度較高．與正常細胞相比，該探針a的CEST信號強度在與A549細胞孵育時顯著增加，證明了其檢測肺癌細胞的能力．我們還將該探針用于低濃度溶液和細胞的CEST成像，并獲得了明顯的成像對比效果，進一步證明了該探針可用于Cat B的超靈敏檢測．

致謝：

感謝國家自然科學基金資助項目國家自然科學基金資助項目（91859206，81625011）；國家重點研發計劃（2016YFC1304704）；中國科學院前沿科學重點研究計劃（QYZDY-SSWSLH018）．

利益沖突：

無

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Cathepsin B Triggered Hyperpolarization129Xe MRI Probe for Ultra-Sensitive Lung Cancer Cells Detection

1,2#，1#，1，1，1*

1. State Key Laboratory of Magnetic Resonance and Atomic and Molecular Physics, National Center for Magnetic Resonance in Wuhan (Wuhan Institute of Physics and Mathematics, Innovation Academy for Precision Measurement Science and Technology, Chinese Academy of Sciences), Wuhan 430071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Cathepsin B (Cat B) is a lysosomal cysteine protease that plays an essential role in cellular metabolism. Cat B is overexpressed in lung cancer cells. Fluorescence imaging techniques have been developed for measuring intracellular Cat B levels, which, however, suffers from limited penetration depth and interferences from autofluorescence background. To resolve these technical difficulties, we designed a novel Cat B biosensor detected by hyperpolarized xenon magnetic resonance imaging. It consists of a cryptophane cage as a129Xe NMR reporter and an amide bond as a Cat B-specific cleavable group. When the biosensor interacts with Cat B, the cleavage of amide bond leads to changes in129Xe chemical shift. Combing with hyperpolarization-chemical exchange saturation transfer (Hyper-CEST), our biosensor provides a novel method for responsive detection of Cat B.

nuclear magnetic resonance (NMR), contrast agents, lung cancer, hyperpolarization129Xe MRI probe, cathepsin B, chemical exchange saturation transfer (CEST)

O482.53

A

10.11938/cjmr20202828

2020-04-25;

2020-05-14

國家自然科學基金資助項目(91859206，81625011)；國家重點研發計劃(2016YFC1304704)；中國科學院前沿科學重點研究計劃(QYZDY-SSWSLH018).

* Tel: 027-87198802, E-mail: xinzhou@wipm.ac.cn.

# 共同第一作者