NtabEXPA12基因過表達對煙草葉片發育及抗逆性的影響

丁安明 陳志華 楊懿德 余祥文 楊洋 鄢敏 楊興有 王衛鋒 孫玉合

摘?要：細胞壁松弛因子膨脹素在調控植物生長發育和響應非生物脅迫等方面發揮重要作用，克隆煙草膨脹素基因并研究其功能可為煙草葉片發育調控和抗逆育種提供理論依據。本研究從普通煙草K326中克隆了一個膨脹素基因NtabEXPA12及其啟動子ProNtabEXPA12，通過實時熒光定量PCR、亞細胞定位和過表達等對該基因進行了功能研究，分析了啟動子包含的順式作用元件和活性。結果表明，NtabEXPA12在煙草葉片中具有較高的表達量;ProNtabEXPA12中包含多個響應高鹽、干旱和植物激素的順式元件，并且其活性受到高鹽、干旱和ABA等的誘導;過表達NtabEXPA12通過調控細胞擴展促進轉基因煙草葉片的生長發育，并可以提高轉基因K326對高鹽和干旱的抗性。因此，NtabEXPA12在煙草葉片發育調控及抗逆育種中具有潛在的應用前景。

關鍵詞：膨脹素;基因功能;葉片發育;耐鹽;抗旱性

Abstract： Expansins play important roles in plant growth and development and plants responses to abiotic stresses. Cloning and studying the functions of tobacco expansin genes will provide a theoretical basis for regulation of tobacco leaf development and tobacco resistance breeding. In this study， we cloned NtabEXPA12 with its promoter ProNtabEXPA12 from tobacco variety K326， studied its function by qPCR， subcellular localization and gene overexpression assays， and analyzed cis-regulatory elements in ProNtabEXPA12 and its promoter activity. The results showed that NtabEXPA12 was highly expressed in tobacco leaves. Various cis-elements in ProNtabEXPA12 were identified which were related to plants responses to salt， drought and plant hormones. And indeed， the activity of ProNtabEXPA12 was strongly induced by NaCl， ABA and drought treatments. We also found that overexpression of NtabEXPA12 promoted cell and leaf expansion， and enhanced abiotic stress tolerance in transgenic K326 plants. Therefore， NtabEXPA12 has potential application values in manipulating tobacco leaf development and tobacco resistance breeding.

Keywords： expansin; gene function; leaf development; slat tolerance; drought resistance

細胞壁為植物生長發育提供基礎支撐，也是植物響應環境變化的一道防御屏障，其主要由纖維素、半纖維素和果膠質多糖構成，還包含少量的離子和細胞壁蛋白如膨脹素等[1-3]。植物生長包括細胞數目增加和細胞體積擴展兩個方面，細胞體積的擴展受其內部膨脹壓力和細胞壁可塑性的協同調控。事實上，細胞壁在為植物細胞提供支撐和保護作用的同時，也是限制細胞生長的主要因素之一[4-5]。因此，植物通過松弛細胞壁多糖之間的相互交聯對細胞壁進行結構重塑，是其調控細胞生長的關鍵環節。

膨脹素（expansin， EXP），又被稱為植物細胞壁擴展蛋白，是參與細胞壁松弛與重構的主要因子之一[6]。研究發現，EXP參與植物生長發育及響應環境變化等多個過程，包括種子萌發[7]、根系建成[8]、植株營養生長[9]、生殖生長及果實的膨大和成熟[10-11]等植物共性發育過程及植物抵抗病蟲侵害[12]、干旱、高鹽[7，13-14]等生物和非生物脅迫過程;也包括某些植物特有的發育現象，如豆科植物根瘤的形成[15]、棉花棉纖維的伸長[16]等。因此，鑒定植物EXP基因的功能對農業生產具有重要的潛在應用前景。

本研究在普通煙草品種K326中克隆了一個煙草膨脹素基因NtabEXPA12，并對其啟動子序列和活性進行了分析;通過基因過表達分析，初步鑒定了NtabEXPA12在調控煙草生長發育和抵抗非生物脅迫等過程中的生物學功能，為煙草葉片發育調控和抗逆育種提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

普通煙草品種K326，擬南芥哥倫比亞生態型。

1.2?試驗方法

1.2.1?試驗材料的種植?將煙草種子點播于清水浸潤的濾紙上或花盆中，種植于中國農業科學院煙草研究所溫室，自然光條件下生長。在苗期、團棵期、旺長期和花期，分別收集發芽的種子、植株的根、莖、葉和花等組織。將擬南芥種子播種到育苗基質上，置于23 ℃人工氣候室中生長，收集蓮座葉片。收集的組織經液氮速凍后放置于?80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2?核酸提取及反轉錄?利用北京全式金生物技術有限公司（TransGen Biotech， Beijing）生產的DNA和RNA提取試劑盒及反轉錄試劑盒依照說明書的步驟分別提取基因組DNA和總RNA，并將1 μg總RNA反轉錄為cDNA，稀釋20倍后放置-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.3?基因及其啟動子克隆與載體構建?依據中國煙草基因組數據庫中基因（命名為NtabEXPA12）和啟動子（命名為ProNtabEXPA12）的DNA序列設計特異性引物，包括基因序列擴增特異性引物NtabEXPA12-F1 5′-ggtaccATGGCTATTAATGACCA A-3′和NtabEXPA12-R1 5′-ggatccTTAGAATTGA CCTCCTTC-3′及啟動子序列擴增特異性引物ProNtabEXPA12-F 5′-ctgcagCATTTCTGTGATTTG TTTTA-3′和ProNtabEXPA12-R 5′-ggtaccTTTGTT ACTTATTGATTGTA-3′，以K326葉片cDNA或基因組DNA為模板，使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司（Vazyme Biotech， Nanjing）生產的Pfu高保真酶，按照說明書的體系和步驟進行PCR擴增，將得到的擴增產物利用北京全式金生物技術有限公司（TransGen Biotech， Beijing）的PCR產物純化試劑盒參照說明書的步驟進行純化后，利用同源重組的方法將基因序列連接到雙元載體p1300-EGFP上，將啟動子序列連接到雙元載體p1300-GUS上，轉化大腸桿菌后利用卡那霉素篩選陽性克隆并送上海派森諾生物科技股份有限公司（Personalbio Biotech， Shanghai）進行測序，得到基因及啟動子的DNA序列，并將測序正確的載體命名為35S：NtabEXPA12和ProNtabEXPA12：GUS。

利用基因序列擴增特異性引物NtabEXPA12-F1和NtabEXPA12-R2 5′-ggatccAGAATTGACCTCCT TC-3′及AtPGIP2-F 5′-ggtaccATGGATAAGACAA TGACACT-3′和AtPGIP2-R 5′-ggatccCTTGCAAC TAGGAAGAGGTG-3′分別以K326和擬南芥葉片cDNA為模板，參照上述的方法進行PCR擴增并將擴增片段分別連接到雙元載體p1300-EGFP和p1300-ERFP上。測序正確的載體被命名為35S：NtabEXPA12-GFP和35S：AtPIPG2-RFP。

1.2.4?實時熒光定量PCR?以cDNA為模板，利用NtabEXPA12的基因特異引物NtabEXPA12-qF 5′-AATTGGCAGAGTCACTCT-3′和NtabEXPA12- qR 5′-AGTTTGACCAAATTGCCA-3′及大連寶生物工程有限公司（Takara， Dalian）的實時定量PCR試劑盒，按照說明書的步驟在實時熒光定量PCR儀上進行qPCR分析，依據2-ΔΔCt算法處理數據。以煙草26S rRNA基因作為內參對照，引物序列為26S rRNA-qF：5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3'，26S rRNA-qR：5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3'。每個樣本設置3個生物學重復、3個技術重復。

1.2.5?啟動子序列分析?利用PlantCARE在線分析軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）對ProNtabEXPA12啟動子的DNA序列中潛在的順式作用元件進行預測分析并繪制順式元件的位置圖。

1.2.6?遺傳轉化?利用熱擊的方法將35S：NtabEXPA12和ProNtabEXPA12：GUS載體分別轉入根癌農桿菌感受態LBA4404（適用煙草）和/或GV3101（適用擬南芥），利用農桿菌介導的葉盤法將35S：NtabEXPA12載體轉化煙草，利用浸花法將ProNtabEXPA12：GUS載體轉化擬南芥。利用潮霉素篩選陽性轉基因植株。

1.2.7?啟動子活性分析?取轉基因擬南芥的幼苗和成株的器官或組織，如根、葉片和花等，利用北京華越洋生物科技有限公司（Huayueyang Biotech， Beijing）生產的GUS染色試劑盒并參照說明書的步驟進行GUS染色，利用解剖鏡觀察并拍照。利用H2O、NaCl、ABA和PEG6000溶液（模擬干旱）處理幼苗后利用上述方法對幼苗進行GUS染色，設置3次生物學重復，觀察不同處理對GUS活性的影響。參照JEFFERSON[17]的方法進行定量分析。

1.2.8?亞細胞定位分析?利用熱擊的方法將35S：NtabEXPA12-GFP和35S：AtPIPG2-RFP載體轉化GV3101感受態細胞，利用農桿菌介導的瞬時轉化的方法注射本氏煙草的葉片，培養3 d后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察注射葉片中的綠色和紅色熒光信號并拍照。

1.2.9?葉片及葉片表皮細胞大小測定?觀察溫室生長的K326和轉基因K326煙株的生長發育情況，取團棵期中部葉片拍照并測量葉片的大小。同時，參照文獻[18]，在團棵期中部葉片背面涂抹指甲油并利用透明膠帶將表皮組織分離，在普通光學顯微鏡下觀察葉片表皮細胞的大小并拍照。利用ImageJ軟件測量細胞面積。

1.2.10?種子萌發試驗?將煙草種子消毒后，點播于分別添加了0.2、0.8 μmol/L ABA和100、150 mmol/L NaCl的MS培養基上，待種子露白時統計種子的發芽率。每個處理設置3次重復，每個重復點播100粒種子。

1.2.11?干旱脅迫試驗?將煙草種子播種于苗穴中，放置于溫室自然光條件下生長。在30 d時對幼苗一次性澆足水后進行干旱處理，30 d后復水，并于復水兩周后觀察煙苗的生長情況并拍照。

2?結?果

2.1?NtabEXPA12的表達模式分析

由表1可以看出，在不同發育時期的組織中，NtabEXPA12在幼苗期和旺長期葉片中的表達量最高，其次是打頂后第5、10和15位葉片，而在根和莖中的表達量相對較低。此外，它在腋芽中也有相對較高的表達量。幼苗在受低溫脅迫時，NtabEXPA12的表達量提高了約16倍;幼苗受干旱脅迫時，其表達量在干旱脅迫第2天達到峰值，隨后迅速下降。

利用實時熒光定量PCR對NtabEXPA12在煙葉中的表達進行進一步驗證，結果表明，相較于其他組織，NtabEXPA12在煙草不同發育時期的葉片中呈現較高的表達量（圖1）。這些結果表明NtabEXPA12具有調控葉片生長發育的功能，在調控煙葉結構中具有潛在的應用價值。

2.2?ProNtabEXPA12啟動子序列及順式調控元件分析

通過克隆和測序獲得了NtabEXPA12起始密碼子ATG上游1500 bp的啟動子序列，命名為ProNtabEXPA12（圖2）。對該DNA片段中潛在的順式元件進行預測，結果表明其包含多個響應高鹽（如GT-1）、干旱（如MYC和MYB）及植物激素（如響應ABA的ABRE、響應JA的CGTCAT和響應SA的SARE）等的調控元件（圖2），說明NtabEXPA12及其啟動子可能在煙草響應非生物脅迫中發揮重要作用。ProNtabEXPA12含有的主要順式調控元件的位置、序列和可能的功能見表2。

2.3?NtabEXPA12的亞細胞定位

膨脹素屬于一類細胞壁蛋白，參與細胞壁結構的重塑[19]。在本氏煙草葉片中瞬時表達NtabEXPA12-GFP融合蛋白，利用激光共聚焦顯微鏡檢測NtabEXPA12的亞細胞定位，結果表明GFP的綠色熒光信號與AtPIPG2-RFP的紅色熒光信號重疊（圖3）。AtPGIP2是一個已知的細胞壁蛋白[20]，二者的共定位說明NtabEXPA12定位于細胞壁上。

2.4?ProNtabEXPA12的啟動子活性分析

獲得了穩定表達ProNtabEXPA12：GUS的擬南芥轉基因株系。對轉基因株系不同發育時期、不同組織進行GUS化學染色檢測ProNtabEXPA12啟動子的表達偏好，結果表明在擬南芥中該啟動子可以廣泛表達，如在幼苗的葉片、蓮座葉、根及花中均有表達（圖4A）。

進一步利用高鹽、干旱等非生物脅迫和植物激素ABA處理轉基因擬南芥幼苗，然后對幼苗進行組織化學染色，結果表明與水處理對照相比在高鹽、干旱和ABA處理時幼苗的GUS活性顯著升高（圖4B和C），說明ProNtabEXPA12的活性受到高鹽、干旱和ABA的強誘導，這與該啟動子中含有相關響應元件的分析結果一致。

2.5?過表達NtabEXPA12對煙草生長發育的調控

在K326基因組克隆了NtabEXPA12基因的編碼序列（圖5A），并構建了CaMV 35S啟動子驅動NtabEXPA12的表達載體（圖5B），獲得了穩定表達Pro35S：NtabEXPA12的煙草轉基因株系（圖5C）。對轉基因株系進行分子檢測，結果表明株系6（OE-6）和OE-11中NtabEXPA12基因轉錄本的豐度較WT明顯提高（圖5D）。進一步對轉基因株系進行表型觀察，發現與野生型相比過表達NtabEXPA12能顯著提高煙株長勢（圖5C）、促進煙葉擴展（圖5E）并增加葉片面積（圖5F）。對團棵期中部葉片表皮細胞進行顯微觀察，結果表明OE-6和OE-11葉片表皮細胞的面積較WT顯著增大（圖5F和G），說明NtabEXPA12通過促進細胞的擴展調控煙葉等器官的生長。

2.6?過表達NtabEXPA12對轉基因煙草抗旱和耐鹽性的影響

2.6.1?過表達NtabEXPA12對煙草耐鹽性的影響?植物激素ABA在鹽脅迫防御中發揮著不可替代的作用[21]。前面的分析結果顯示ProNtabEXPA12中包含多個響應ABA信號的ABRE元件，推測NtabEXPA12參與煙草對高鹽脅迫的響應。為進一步驗證NtabEXPA12的功能，利用ABA處理煙草種子并進行萌發試驗（圖6A），結果表明在對照組水處理中，K326和轉基因株系的種子萌發率均在90%以上，且差異不顯著。ABA處理能顯著抑制對照K326的種子萌發，其在0.2 μmol/L ABA處理時萌發率約為60%，在0.8 μmol/L ABA處理時萌發率僅為約15%;而OE-6和OE-11的種子萌發率均在70%左右（圖6B），說明過表達NtabEXPA12能抑制轉基因植株對ABA的敏感性，提高種子發芽率。進一步利用不同濃度的NaCl對種子進行處理，發現100 mmol/L NaCl處理條件下，對照K326種子已經少有萌發，而OE-6和OE-11的種子萌發率仍然達到50%和25%;150 mmol/L NaCl處理條件下，對照K326種子不萌發，而仍然有5%左右的OE-6和OE-11轉基因種子可以萌發（圖6），說明過表達NtabEXPA12能顯著提高轉基因煙草對高鹽的耐受性。

2.6.2?過表達NtabEXPA12對煙草抗旱性的影響?對穴栽煙苗進行了干旱和復水處理，結果表明干旱處理30 d后K326和OE-11轉基因煙苗均表現失水萎蔫、葉片退綠干枯的現象;復水14 d后，OE-11重新長出了新葉，而K326仍然表現為接近死亡的狀態（圖7），說明過表達NtabEXPA12提高了轉基因煙草的抗旱性及干旱條件下煙苗的存活率。

3?討?論

葉片結構是影響煙草品質的關鍵因素之一，而關于如何在分子水平上調控和改善煙葉結構的研究仍然較少。植物細胞壁松弛因子膨脹素能夠調節細胞壁多糖組份之間的交聯程度，通過對細胞壁的物理結構進行重塑參與包括葉片擴展等植物生長發育的多個方面[7-11]，因而是進行煙葉結構調控的潛在靶標[22]。我們前期在煙草基因組中鑒定了52個EXP基因，并發現一些EXPs在煙草葉片中偏好表達，是參與煙葉發育的潛在調控因子[23]。因此，對它們進行進一步的功能研究，有助于了解煙葉發育的分子機制，并為煙葉結構的分子調控提供理論支撐。

本研究克隆了一個煙草膨脹素基因NtabEXPA12及其啟動子，表達分析發現其在煙草葉片中具有較高的表達量，表明該基因可能參與煙葉生長發育調控。為研究NtabEXPA12的生物學功能，利用轉基因技術獲得了基因表達量顯著增加的過表達株系OE-6和OE-11。通過溫室試驗發現，與野生型K326相比，過表達NtabEXPA12能夠顯著促進壯苗培育和葉片擴展。葉片發育受到細胞增殖與細胞體積增大的共同調節。研究認為，膨脹素通過破壞細胞壁結構多糖之間的非共價相互作用使細胞壁的結構變得松弛，引起細胞內部壓力降低，而負壓可以促進水分進入細胞從而增大細胞體積并使細胞的膨脹壓力恢復平衡，完成細胞的擴張和器官體積/面積的增加[24]。為進一步探明過表達株系葉片表型形成的分子基礎，通過葉片細胞顯微檢測，發現NtabEXPA12以促進細胞體積增大的方式促進煙草葉片的擴展。

研究表明，膨脹素能通過調控細胞壁的結構，提高植物對干旱、鹽和冷害等非生物脅迫的耐受性或抗性[12-14]。本研究在ProNtabEXPA12啟動子序列中發現多個響應高鹽、干旱及植物激素的順式調控元件，并發現該啟動子的活性受到高鹽、干旱和ABA等的誘導。經過進一步試驗驗證發現過表達NtabEXPA12能夠促進種子在鹽脅迫和含ABA培養基上的萌發率，并提高極端干旱脅迫條件下轉基因植株的存活率，這與以往的研究結果[12-14]一致。以上結果說明，NtabEXPA12及其啟動子在煙草抵御逆境中起到正向調控作用。然而關于NtabEXPA12基因的轉錄調控模式等問題仍需更加深入的研究。

綜上，膨脹素既有促進煙葉發育的作用，又能提高煙株的抗逆性，因此是煙草生物育種中理想的調控對象。然而，過表達NtabEXPA12的轉基因煙草由于葉片結構改變，可能會對煙葉的品質造成影響。已有的研究結果表明，膨脹素可以松弛細胞壁的網絡結構，使細胞壁的結構變得疏松[2，25-26]，從而有利于柔軟煙葉的形成和提高煙葉品質。該推測還有待于對轉基因煙草進行品質評價來進一步驗證。

4?結?論

本研究克隆并初步驗證了一個煙草膨脹素基因NtabEXPA12及其啟動子的結構和功能。結果表明ProNtabEXPA12含有多個響應高鹽、干旱及植物激素的順式調控元件，且其表達受到干旱、高鹽脅迫和ABA的誘導。在K326中過表達NtabEXPA12能通過促進細胞體積增大的方式促進煙葉擴展，并能提高轉基因煙草種子在逆境條件下的萌發率，提高轉基因植株對高鹽、干旱等非生物脅迫的抗性。因此，本研究為煙草葉片發育調控和抗逆分子育種提供了重要的理論依據。

參考文獻

[1]張保才，周奕華. 植物細胞壁形成機制的新進展[J]. 中國科學：生命科學，2015，45（6）：544-556.

ZHANG B C， ZHOU Y H. Plant cell wall formation and regulation[J]. Scientia Sinica Vitae， 2015， 45（6）： 544-556.

[2]COSGROVE D J. Cell wall loosening by expansins[J]. Plant Physiology， 1998， 118（2）： 333-339.

[3]WOLF S， MOUILLE G， and PELLOUX J. Homogalacturonan methyl-esterification and plant development[J]. Molecular Plant， 2009， 2（5）： 851-860.

[4]黃成，李來庚. 植物細胞壁研究與生物質改造利用[J]. 科學通報，2016，61（34）：3623-3629.

HUANG C， LI L G. Understanding of plant cell wall biosynthesis for utilization of lignocellulosic biomass resources[J]. Chinese Science Bulletin， 2016， 61（34）： 3623-3629.

[5]HOFTE H， VOXEUR A. Plant cell walls[J]. Current Biology， 2017， 27（17）： R865-R870.

[6]COSGROVE D J， LI Z C. Role of expansin in cell enlargement of oat coleoptiles （analysis of developmental gradients and photocontrol）[J]. Plant Physiology， 1993， 103（4）： 1321-1328.

[7]YAN A， WU M， YAN L， et al. AtEXP2 is involved in seed germination and abiotic stress response in Arabidopsis[J]. PloS One， 2014， 9（1）： e85208.

[8]ZOU H， WEN Y， ZANG G， et al. OsEXPB2， a β-expansin gene， is involved in rice root system architecture[J]. Molecular Breeding， 2015， 35： 41.

[9]CHOI D， LEE Y， CHO H T， et al. Regulation of expansin gene expression affects growth and development in transgenic rice plants[J]. The Plant Cell， 2003， 15（6）： 1386-1398.

[10]BRUMMELL D A， HARPSTER M H， DUNSMUIR P. Differential expression of expansin gene family members during growth and ripening of tomato fruit[J]. Plant Molecular Biology， 1999， 39（1）： 161-169.

[11]HIWASA K， ROSE J K， NAKANO R， et al. Differential expression of seven alpha-expansin genes during growth and ripening of pear fruit[J]. Physiologia Plantarum， 2003， 117（4）： 564-572.

[12]LI W， WANG F， WANG J， et al. Overexpressing CYP71Z2 enhances resistance to bacterial blight by suppressing auxin biosynthesis in rice[J]. PloS One， 2015， 10（3）： e0119867.

[13]LU P， KANG M， JIANG X， et al. RhEXPA4， a rose expansin gene， modulates leaf growth and confers drought and salt tolerance to Arabidopsis[J]. Planta， 2013， 237（6）： 1547-1559.

[14]GEILFUS C M， OBER D， EICHACKER L A， et al. Down-regulation of ZmEXPB6 （Zea mays β-expansin 6） protein is correlated with salt-mediated growth reduction in the leaves of Z. mays L.[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2015， 290（18）： 11235-11245.

[15]LI X， ZHAO J， TAN Z， et al. GmEXPB2， a cell wall β-expansin， affects soybean nodulation through modifying root architecture and promoting nodule formation and development[J]. Plant Physiology， 2015， 169（4）： 2640-2653.

[16]HARMER S E， ORFORD S J， TIMMIS J N. Characterisation of six alpha-expansin genes in Gossypium hirsutum （upland cotton）[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2002， 268（1）： 1-9.

[17]JEFFERSON R A. Assaying chimeric genes in plants： the GUS gene fusion system[J]. Plant Molecular Biology Reports， 1987， 5： 387-405.

[18]侯蕾，陳龍俊. 鹽脅迫對擬南芥葉片和下表皮細胞大小的影響[J]. 安徽農業科學，2011，39（13）：7615-7616.

HOU L， CHEN L J. Effects of salt stress on epidermal cell expansion in leaves of Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Anhui Agricultural Science， 2011， 39（13）： 7615-7616.

[19]COSGROVE D J. Loosening of plant cell walls by expansins[J]. Nature， 2000， 407（6802）： 321-326.

[20]DE CAROLI M， MANNO E， PERROTTA C， et al. CesA6 and PGIP2 endocytosis involves different subpopulations of TGN-related endosomes[J]. Frontiers in Plant Science， 2020， 11： 350.

[21]WASKIEWICZ A， BESZTERDA M， GOLINSKI P. ABA： role in plant signaling under salt stress[M]//AHMAD P， AZOOZ M M， PRASAD M N V. Salt stress in plants （eds）. New York： Springer， 2013： 157-173.

[22]MAROWA P， DING A M， KONG Y Z. Expansins： roles in plant growth and potential applications in crop improvement[J]. Plant Cell Reports， 2016， 35（5）： 949-965.

[23]DING A M， MAROWA P， KONG Y Z. Genome-wide identification of the expansin gene family in tobacco （Nicotiana tabacum）[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2016， 291（5）： 1891-1907.

[24]COSGROVE D J. Growth of the plant cell wall[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2005， 6（11）： 850-861.

[25]TAIZ L. Expansins： proteins that promote cell wall loosening in plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1994， 91（16）： 7387-7389.

[26]COSGROVE D J. Plant expansins： diversity and interactions with plant cell walls[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2015， 25： 162-172.